培养箱真菌污染的处理。

蓝O海

最近培养细胞污染了好几瓶，怎么验证培养箱是否真菌污染，还有怎么处理。
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sun_happone

细胞污染不一定是培养箱造成的，操作上很多可能导致。如果要判定培养箱是否有污染，就做个无菌实验吧，把确定无菌的没有细胞的培养基放入培养箱，看看培养基会不会污染，如果没有污染，说明培养箱也没有；如果培养基污染了，那就给你的培养箱消消毒咯~~~

deshenglll

回复 蓝O海 的帖子& A( d( R5 v; z: y# X9 I2 @
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你先把原因排查一下，看是人员还是设备的问题。实验室再好好的大扫一下。

mania7041

一、确定是否真菌污染，因为实验室真菌污染是很麻烦的一件事，一般的细菌污染使用75%酒精消毒就可以了，可是真菌就不一样了，要使用强效的消毒剂，例如甲醛、新洁尔灭（也行），然后还要使用紫外线消毒。
( \  V( h- e5 a! K+ x  d4 }二、如何处理   首先彻底清除有真菌的位置，使用联合消毒的方式清洁培养箱" ~6 z% Q' r3 K! k7 K2 \
三、如何保持   定期清洁培养箱及水盘（最有可能产生真菌的位置），一般清洁周期为两周

jack1381818

凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物，都应视为污染，包括细菌、真菌、支原体、病毒、异种培养物和化学物质等。
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1 q" G& z' a, x0 o3 ]2 G$ i细菌污染及判断
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  大多数细菌（bacteria）污染可以改变培养液pH，使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞。细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
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( f$ u: q+ N) p  当怀疑培养细胞有细菌污染时，取10ml细胞悬液1000rpm离心5分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞置培养箱培养。若培养物受细菌污染，24～48小时内可以获得阳性结果。联合使用青霉素、链霉素对预防细菌污染有效。
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) Y' \8 w$ P, d' x& q/ G; o$ [. ` 真菌污染及判断
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& P; a2 c% I5 M8 \! A  真菌（fungus）污染易于发现，一般在培养液中有肉眼可见的白色或浅黄色的漂浮小点，念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间，个体细小，有增多趋势，培养液一般不混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。培养细胞受真菌污染后，细胞生长变慢，最后由于营养耗尽及毒性作用可使细胞脱落、死亡。抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。& z# V1 b1 {6 A4 i  J$ ?+ u

, P8 d* I( o4 P; X' A, I支原体污染及判断, B0 s8 r- b% y2 l/ g8 R$ k% _) s
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  支原体（mycoplasma）是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，直径0.22μm左右，无细胞壁，对理化因素比较敏感。受污染的细胞在显微镜下无特殊的外观表现，培养液也不浑浊；部分敏感细胞生长增殖变慢，细胞变圆，脱落。在细胞培养过程中，如在显微镜下发现破碎的细胞有许多，培养物需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应怀疑培养物可能受支原体污染。支原体可通过培养法、DNA荧光染色法、聚合酶链式反应、免疫学等方法进行检测。/ {( C: Z) [9 b# O8 v! Z, u

- q. M. ^1 D& Z/ e$ r病毒污染及判断
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  新引入的细胞系、天然产物（如血清）和胰蛋白酶均是潜在的病毒污染来源。感染了病毒的宿主细胞形态学上不一定有显著的特异性的改变，应用电子显微镜观察或进行免疫学染色可判断细胞是否被病毒污染。
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9 W) W) C5 L# P4 C( A: k$ T8 ]1 J其它污染
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  由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，操作不当，往往会发生细胞交叉污染。因此尽量不要同时操作两种或两种以上细胞株。: }6 b4 b. g1 J1 }

0 |& ~, N4 e' h7 o& {! K# L" R8 G  非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。
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污染的排除
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  一般的原则是应将污染的细胞弃去，而不要试图去除污染，非常重要的细胞株才考虑去除污染，但在任何情况下，污染都很难完全被消除。4 A. Q- G" k$ j# T
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  1)细菌污染的排除：可使用大剂量抗生素冲击法，向污染的细胞培养液中加入大剂量的抗革兰氏阳性和阴性细菌的抗生素，一般采用5～10倍于常用量进行用药，加入高浓度抗生素后作用24－48小时，再换入常规的培养液，有时可以奏效。, `) \6 Z2 b2 N8 S! u9 q
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  2)支原体的排除：卡那霉素、庆大霉素、支原体去除因子（MRA）、卷须霉素及BM-Cycline等对抗支原体是有活性的，可使用它们抑制或消除支原体。
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细胞培养箱的清洁和消毒
. f# ~! S+ p& Z0 Y; o+ C0 m 1. 培养箱消毒：先用纯水擦洗，再用95的酒精擦洗，再照紫外就可以拉!注意周围环境的清洁就不会那么容易污染的拉!
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! ^7 u+ |1 V# a4 [+ s2. 我的经验是在补充水时最好把水加热一下，达到培养箱的温度。% V1 N% B; h6 z) u7 _* q7 r
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3. 这么早就养细胞了，我们这里一般是用70%的乙醇擦洗，然后再用0.1%的新洁尔灭擦洗，不放心的话再用高锰酸钾加甲醛1：1比例熏一遍。注意要是熏的话千万注意混合之后马上离开，然后密闭细胞培养室，味道很刺激的。最好在养细胞前消毒，否则，确实没地方放细胞。$ d( y! {8 G, I) V
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4. 我们的方法比较简单，先用75%酒精擦拭内壁，通风10分钟，紫外线照射30分钟即可。
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2 `4 d5 r9 p2 u* Q8 W9 v/ S* h5. 我们的通常处理是先用75%的酒精擦拭内壁，然后用甲醛+高锰酸钾熏蒸一个晚上，然后通风一整天(同时打开紫外线照射)。+ L% d! p3 {' ~% [8 B

: F+ t1 K8 q0 \. P3 ?6. 我们是把培养箱里的板层拿出来高压一下，箱壁用75%酒精擦一遍，换用诗乐氏擦一遍，再紫外照一夜，效果很好，其他的请高手指教。" x  r: L' ~  J% S% _! w( s
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7.一般实验室长了霉菌的话，肯定要全部消毒。+ p6 q; Z" k  U8 g
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再消毒实验室，先把室内空调和消毒柜过滤网都拆下清洗，在锥形瓶内加点高锰酸钾，放在实验室地上，然后倒入甲醛，立马关门走人就可以了。
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- y8 w- `2 w/ Z9 z, A2天后再开门装好东西，和往常一样开始工作了。由于2天不能做事，个人细胞要先计划好，大家都可以休息两天。

cqstemcell

做个对比实验就能知道是什么原因污染了！

三月桂花香

做个无菌检测，确定是不是真菌污染，然后再进行培养进行鉴定，另外看看人员操作，培养机，及操作过程中是不是注意到了无菌，如果确定污染，要彻底的打扫卫生了~

184lj

培养箱里面肯定会张菌的，要定期更换水盘里面的水；一般来说，大部分细胞污染是发生在操作的过程中。

jianglei_sd

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7 e: F' J7 B5 S培养箱里做个空气培养。臭氧熏蒸的办法对真菌还是不错的。+ r! \) q+ M& V7 E( v! y9 i" L" w; ^

! }$ Z, p4 w6 ]0 Q& y/ D个人认为甲醛熏蒸对环境的污染真是太严重了！

chimo100

培养箱要定期把所有培养细胞都拿出来，然后把整个培养箱用75%酒精擦拭一遍，然后可以再用新洁尔灭擦拭一遍。水槽里的水最好用高压灭菌过的水。