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本帖最后由 细胞海洋 于 2013-7-12 19:13 编辑 - _7 X9 T6 p. |
8 |! J4 F! n; A6 i/ w" W) G噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。% Z. e3 h$ k8 H# S7 b
关键词：DNA连接酶TakaraNEBFermentas3 r/ P3 f3 e6 M
DNA连接酶 (EC 6.5.1.1) 是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。 / N, _; S8 l$ z/ V4 c: F
大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。' t! d5 @, I! X' B* S9 M5 f6 z; c9 M
噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。
% P2 U+ Z. p1 D9 I- a哺乳动物细胞里有四种DNA连接酶，分别为I、II、III、IV，功能各有侧重。
( k r2 y: t# [# H7 D aDNA ligase I： ligates Okazaki fragments during lagging strand DNA replication and some recombinant fragments.5 b. l& o6 x: D
DNA ligase II： alternatively spliced form of DNA ligase III found in non-piding cells.
9 n7 u" f8 M. p% M. y z& fDNA ligase III： complexes with DNA repair protein XRCC1 to aid in sealing base excision mutations and recombinant fragments.9 L0 v3 \& Z, b: j3 N( b
DNA ligase IV： complexes with XRCC4. It catalyzes the final step in the non-homologous end joining DNA double-strand break repair pathway. It is also required for V(D)J recombination, the process which generates persity in immunoglobulin and T-cell receptor loci during immune system development.6 I2 u2 H: b z" ?- H7 [; r" o
/ s5 c; R7 R6 ^+ M
来看两张有关DNA连接酶及其作用机制的图片吧：0 |4 ^. ?- b5 J$ Y/ ~& [4 C( P
+ \7 h2 t# P8 {/ z
7 n# Z6 R1 l$ O4 K4 k
分子克隆实验中，T4 DNA连接酶是一个重要的工具酶。虽然现在也有不少不依赖连接反应的克隆方法，但利用连接反应来构建克隆或表达重组载体依然是多数人常用的手段。这里通过比较几家著名生物公司的T4 DNA连接酶产品说明书，点出平时实验中我们不太注意的一些常识性细节。
! l6 V+ `9 ?! z/ S9 R. i关于T4 DNA连接酶性质的描述：
9 I: V( F0 L* UT4 DNA Ligase catalyzes the formation of phosphodiester bonds between 3′-OH termini and 5′-P termini of doublestranded DNA. It requires Mg2+ and ATP as cofactors. Enzyme-AMP complex is formed as an intermediate and it reacts on DNA. This enzyme can ligate both cohesive end pair and blunt end pair.) Z4 W+ j4 _' z% l( V C: t
几家公司的Description大概内容差不多，本来也这就这样子。4 r5 r& U% D4 M' v+ h1 u% `$ ~6 G
关于T4 DNA连接酶活力单位的定义：
% e! V# P- y4 K1 @' B主要有两种定义方式，Weiss unit和cohesive-end ligation unit。. { k8 T1 }' a
One cohesive-end ligation unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of lambda DNA in 30 min at 16°C in 20 μl of the assay mixture: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml BSA and a 5'-DNA termini concentration of 0.12 μM (300 μg/ml). （这几家公司的描述是一致的，看来该定义方法是通用的）8 p( U( F0 i! o5 b& R7 }% P
Weiss unit活力单位的定义有差别，Takara公司产品说明上1 cohesive-end ligation unit对应0.008 Weiss unit；而Fermentas公司网站上的换算比例为1 cohesive-end ligation unit对应0.005 Weiss unit。! q! g# ]$ [# k/ P. B
其他方面的描述，这几个公司各有千秋，下面就一一列举出来：
1 |$ r0 }0 o- J& Z, ]; D$ NTakara公司给出了不同限制性内切酶切出的粘性末端的连接效率比较：
7 w! D, f P- D2 R1 n+ xCohesive-end ligation : Hind III > Pst I > EcoR I > BamH I > Sal I
6 W* \, R& `5 KBlunt-end ligation : Hae III > Alu I > Hinc II > Sma I；EcoR V > Sca I > Pvu II > Nru I
4 D7 o$ f) @$ v5 P& h; v$ X4 gFermentas公司则在注意事项（Notes）中提及实用的几点Tips：
W% `* E/ X' P7 z) j5 F①PEG可以提高连接反应的速率，一般用PEG4000，建议终浓度（w/v）5%；②连接酶会结合在DNA上造成电泳时DNA的迁移率发生改变，可以将连接反应后的体系与6X Loading Dye & SDS Solution混合后65°C水浴10分钟，再转移到冰上放置一会儿再跑电泳；③连接产物转化前应将DNA连接酶去除（好像没有必要）
. S* e H* T( b3 }& g% Y7 U, ENEB公司网站上的说明更详细，且配有电泳图来说明连接的效率，这里就不贴了，到NEB网站上去看吧。# i+ Z! o4 C Y9 D
; N# L' R: E1 n* w6 b3 a
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发表于 2013-7-12 17:27
