质粒提取不纯

like_gj

最近做克隆，提取的质粒测序是正确的，反馈信息说信号不好
/ T2 E6 q! ^4 }我自己跑电泳时发现总是有两个质粒条带（开环，共价闭合，线型算一个质粒）我需要的是8K
4 w# L8 k5 n1 M/ r大约在4K左右还有一条& K, l+ z. V6 G/ r' m
然后我用这些质粒重新做转化，挑单克隆，提质粒后发现还是有杂带
. W4 Y1 U5 O* |  v+ J1 ?请问如何清除这些砸质粒？1 l0 C) i4 D# W; y

like_gj

另外，我用感受态直接摇菌培养" {7 L& Y; A" j! ~
提取的质粒大约40ng/ul (共70ul)，请问这个感受态是不是有问题？

mckf111

like_gj 发表于 2013-7-15 15:26
) E; b& I/ t. |5 T# C) E1 M3 o( N  [另外，我用感受态直接摇菌培养
, t4 C0 T! d; V& o& ]: H/ ^0 B提取的质粒大约40ng/ul (共70ul)，请问这个感受态是不是有问题？

/ R3 Q5 P# Z+ Q" X, A6 @: e1 L( `, b6 L感受态应该是空菌 不含质粒 应该考虑重新购买了

Dancmacabre

40ng/ul，这个质粒的OD值很低。建议你直接菌种划线，最好挑几个单克隆做下PCR检测，接阳性单克隆于试管在摇床培养。最好分析一下该质粒的基因序列，如果是你自己构建的克隆，你要弄明白它的功能区里面是否插入致死因子编码区，或者有其他增强型的表达蛋白，有可能会决定你的质粒拷贝数很低。至于有一个4K条带，那可能是断裂的DNA片段，你可以做一下PEG纯化，若效果不明显，只能做胶回收。

chenhuachen

小弟现在做p53对转化细胞代谢的影响，急求TET四环素诱导的wt-p53质粒，对接下来的实验非常重要，跪求论坛里的园友谁有这个质粒，可否赠小弟一点，不胜感激！
* S5 M0 @0 S2 T) Q% c  K) ]人的或者大鼠的野生型p53都可以。