囊胚TUNEL染色的计数问题

a2782953

如下图，如何界定发生凋亡的是几个细胞呢？那些小亮点算不算是发生了凋亡的细胞呢？感觉很乱，哪位有经验的同学来解答下！谢谢了！
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2013-8-14 09:03 上传

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sjm1203

LZ  额  目测这个图片可能你压得有点太重了 所以有点压扁  才出现这些碎裂的细胞的样子 $ }, q# u# q+ ~) J# }: Z
           这样看凋亡的细胞可能是8个  小亮点应该是压碎了的细胞出现的  应该把它归到周边附近的大的细胞去

a2782953

回复 sjm1203 的帖子* g. H- Y' d: ]3 |1 B: Q; P
7 {3 @9 b: w5 {: b' Y
有这个可能，谢谢了！

cbjonathan

囊胚染色的方法 大致有什么protocal吗

a2782953

回复 cbjonathan 的帖子1 \/ t1 q' k" a8 g- c8 B
& g/ ~4 I5 Y' X! r1 ?2 q; K5 b
1.将囊胚从培养液中转移到PBS-PVA中洗三次（过三个洗滴）在含有0.5%Triton-x 100的4%多聚甲醛中固定通透40min（此处自己根据习惯选择固定通透用的容器，因为含有Triton x-100，所以无法做成滴，即使用疏水笔画圈也不行，所以我选择的是200微升的离心管作为固定通透用的容器）。& [4 f7 ^( A& ]/ X7 O, m7 f
2.配制TUNEL反应液，在3.5厘米培养皿底部用疏水笔画个小圈，将TUNEL反应液转移到小圈中，将胚胎在PBS-PVA中洗三次（3min/次）后，置入TUNEL反应液中（转移胚胎时候尽量少带液体进去），37摄氏度细胞培养箱中反应45min。; W3 ~1 x2 c8 c  T8 L- p' `0 @
3.将培养盘从细胞培养箱中取出，DAPI或者其他DNA染色剂（PI，H33342等）染色，之后在荧光显微镜下观察。

cbjonathan

回复 a2782953 的帖子8 s" A5 n4 k1 n6 J

) U: P- z) m* W( h2 y染完DAPI之后，是不是存在一个飘着没法定位照相的问题，是要压张盖玻片吗？ 谢谢

a2782953

回复 cbjonathan 的帖子, d$ C, Y: N5 K+ Z3 D6 m2 e; d; a
' n4 I4 A! `* L( U0 S  x
是的，我是照相前压上盖玻片的。

cbjonathan

回复 a2782953 的帖子
' Y8 m3 x# a  W; ~8 u" G1 n2 e/ p! M5 T8 q6 \7 y7 e
想请问个细节，比如最后我染完了，我是需要将胚胎移至防脱载玻片上，然后加中性树脂，然后加盖玻片吗？
7 R- O# p, T, X7 s5 H+ I然后我不用共聚焦显微镜，用普通的荧光显微镜可以吗？

a2782953

回复 cbjonathan 的帖子- m4 A! @6 ^$ u. Y( Q; e5 o

( }  ?' K  N. p* y1 C我没用过共聚焦显微镜，我一直用的奥林巴斯的荧光显微镜，我也没用防脱片的载玻片，没有封过片，因为我没有保存过，我都是染完了观察或者照相然后就扔了，所以我也不知道这个能否用封片的方法保存后观察。不过在不封片的情况下，在湿盒里面放置一天是没有问题的。封片的话应该最好加放置荧光淬灭的封片剂吧，不知道论坛里其他人是否做过这个。

moonison

小亮点不是的，那是细胞的碎片，操作还是粗糙了一些，可以注意一下啊。