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本帖最后由 hualin840518 于 2013-9-9 22:49 编辑
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. e; ~6 L8 c0 U/ D: ACRISPR-Cas9基因敲除技术了解学习-本文引用地址：http://bbs.sciencenet.cn/blog-472747-723581.html
/ l, ~5 h4 I: o6 O" s4 b' G% C Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) systems. (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas) 是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。
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/ s( l `1 L# s( P7 h P在1987年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现了邻近的一个不同寻常的DNA片段，这一DNA片段中间是一段短直接重复核苷酸序列，两侧为短特异片段。他们当时指出“这些序列的生物学意义尚不清楚”。在几乎过去快30年后，这一最初看起来不起眼的研究发现，现在为简易操控大量生物体的基因组打开了大门。
5 I q0 ?- `. @" j) ^1. 两篇science 文章证明CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞有效
$ J0 h( n$ `2 G) b9 n* X2013年2月15日发表在《科学》（Science）的两篇文章，证明Cas9系统能在293T, K562, iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组（NHEJ）、同源重组（HR）效率在3-25%之间，与TALEN酶切效果相当。文章还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。这些工作将进一步靶向基因操纵推向高潮，使得多个基因敲除、敲入变得更为简单、高效。虽然目前，大家对该技术的特异性，免疫原性还了解甚少，但是随着研究的不断深入，一定会有很大的改善。在未来的2-3年，动植物育种、干细胞定向分化、遗传疾定点修复等等都将得到迅猛的发展。
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图1. RNA指导的CRISPR/Cas9基因剪切系统8 S/ @2 z& h+ F( \" G$ P+ z/ V
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图2. 利用CRISPRCas进行基因组工程，图中不同颜色的剪刀代表着不同的Cas9酶
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RNA-Guided Human Genome Engineering viaCas9 Science. 2013 Feb 15 339(6121):823-6. $ G6 n* a6 J7 G; [
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23287722
9 L# T/ t b& H6 PMultiplex Genome Engineering UsingCRISPR/Cas Systems Science. 2013 Feb 15 339(6121):819-23." c( G. v4 J+ Q
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23287718
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2. 模式动物构建革命：CRISPR/Cas技术一次性构建多突变转基因鼠
* v4 w& G& i) E* m& q曾构建第一只转基因小鼠的Rudolf Jaenisch教授采用CRISPR/Cas技术成功构建了同时携带多个基因突变的小鼠。CRISPR/Cas技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，且可绕开胚胎干细胞操作过程。该技术将重新定义模式动物。
$ Z+ m6 o; I) ARudolf Jaenisch教授是MIT怀特黑德研究所（WhiteheadInstitute）的创始成员，在1974年，他通过将SV40 病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，构建了第一只转基因小鼠，从而改变了遗传学研究。而现在，Rudolf Jaenisch教授将再一次革新基因修饰模式动物的生产技术，甚至有可能重新定义哪些物种可以作为模式物种。“我们现在可以在三到四个星期内生产一只携带5个突变的小鼠，而传统的技术要达到这一目标需要花费3到4年。并且这一技术相当简单，甚至可能比传统方法还要简便。” o2 ~( S5 |4 M; Q8 m; O7 ?, e( t
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通过改变与特定疾病相关的基因，科学家们可以利用小鼠建立疾病模式。利用这些疾病模式动物，研究者可以对疾病的发生及发展，以及各种干预措施（包括遗传学与化学手段）对疾病的影响进行研究。在过去的20年中，建立疾病模式动物的方法基本没什么变化：首先将特定的DNA片段插入到小鼠胚胎干细胞中，在将修饰过的干细胞植入到早期胚胎（即囊胚）中，然后将发育中的细胞移植到雌性小鼠中。通过这种方式建立单基因敲出的小鼠品系可能需要花费数年和数十万美元的成本。并且这种基因敲出的技术还仅局限于小鼠、大鼠等少数物种中应用。
- T; r$ W# o% S- x5 b/ x) ^Rudolf Jaenisch教授实验室采用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞操作过程，可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。这是CRISPR/Cas技术首次被用于多细胞生物的基因操作。# ~0 k5 L3 E* Q0 t( W3 X s3 s W
据Rudolf Jaenisch教授的学生Chikdu Shivalila介绍，利用CRISPR/Cas技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，“我们可以非常高效率地在四个位点上对两个基因进行敲出，效率达到了80%左右。如果利用TALENT技术，我们进行单基因敲出的效率只有30%。” Shivalila相信这一技术将很快在需要建立基因突变鼠的研究机构中得到应用。7 u' F# B6 O3 ]/ G& e; v, e( H
在目前的模式动物生产技术中，胚胎干细胞是一个绕不开的过程。而CRISPR/Cas技术则无需胚胎干细胞，因此遗传学研究可能将不再局限于有限种类的模式生物了。“这打破了模式生物的定义。现在，任何可以进行胚胎操作的动物都可以成为基因组工程的研究目标。由于许多动物的基因组已经完成测序，因此，利用这一技术我们可以在更多的物种中进行高效的遗传操作。”
- D9 w. x2 o0 Y; S同时研究者也指出，对于利用CRISPR/Cas技术构建模式动物还需要开展更进一步的研究，看是否存在预期外的效果，是否会对基因组产生设计外的改变。( T F9 ~0 V, W$ b' X m/ t8 L7 s
vip-2013. 利用CRISPRCas系统快速和高效地培育转基因小鼠One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes byCRISPRCas-Mediated Genome Engineering. Cell, Volume 153, Issue 4, 910-918, 02May 2013
7 a) O: u6 o9 x( \/ V" ehttp://www.cell.com/abstract/S0092-8674(13)00467-4
; I2 q/ {0 x+ e( B. [* y2 C, x3. CRISPR/Cas技术灵魂人物——Feng Zhang（张锋）
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MIT麦戈文脑研究所（McGovernInstitute for Brain Research）助理教授Feng Zhang获得瓦利基金青年研究家奖（Vallee Foundation Young Investigator Award）。Feng Zhang目前的研究方向是设计新的分子工具来操控活体大脑，他同时也是布罗德研究所（Broad Institute）的核心成员。. q* m3 {5 T t3 e
这位年仅31岁（2013）CRISPR/Cas技术灵魂人物到底有多NB，话不多说，直接来他实验室主页看http://zlab.mit.edu/publications.html- s, N3 n) r3 m/ u
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（真是高产啊，这里面的论文都可以免费下载的哦！！）1 X+ W1 N/ U' _; z- R0 |4 b7 o7 o% F
# p9 c. x+ }1 N0 c6 a8 v6 w作为一个学习者，Feng Zhang的两篇最新的CRISPR-Cas论文是必需要学习的：8 f) T+ C: z9 V `4 p
2013.改善CRISPRCas系统基因组编辑准确性DNAtargeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.NatBiotechnol doi:10.1038/nbt.2647 (2013)( L/ Z2 r: w/ ^* m) Z& w5 ^
http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/nbt.2647/metrics+ n3 ^! X' l/ g- y4 z
2013. 8月29日Cell新论文DoubleNicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Cell,29 August 2013. 10.1016/j.cell.2013.08.021
$ H& p0 D% O: d- N, Uhttp://www.cell.com/abstract/S0092-8674(13)01015-5
+ k8 k" k# m" f1 Y2 @& ~ ) i9 p8 y$ h' v
文献太多，这里给3篇Feng Zhang的新论文全文！7 _* U5 |! |6 ]4 u
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发表于 2013-9-9 22:42
发表于 2013-9-10 09:39
