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2.2.2 脐带血造血干细胞的分离
9 K! y4 |' M1 J往50 mL离心管里加入15 mL已经恢复至常温的新鲜脐带血，再往脐带血里加入等体积（15 mL）的已经恢复至常温的羟乙基淀粉-550，轻柔混匀，37℃水浴10min。
7 X8 V L8 Q: v5 b以上体系中加入15 mL的PBS，轻柔混匀，室温自然沉降40min，吸取淡红色混浊的上清液备用，弃去底部红细胞。
- j, C$ a' X. K向上述步骤中得到的上清液中加入一倍以上体积的PBS，轻柔混匀以500g离心15 min，弃去上清保留细胞沉淀。
$ i6 h/ F3 R) E! G5 z* l8 X往细胞沉淀中加入一定量的PBS并重悬细胞，将重悬好的细胞沿管壁缓慢加入事先已经加好等体积Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液的15mL离心管中。: _+ m$ p3 t% g1 A5 A, P1 d$ ^
400g离心30~40 分钟，转移中间白膜层细胞至另一管，加入3倍以上体积的PBS，混匀，300g离心10分钟，去除上清，再加入8~10mL的MACS Buffer，混匀，吸取50μL用于细胞计数，剩余的细胞300g离心10分钟。
" u0 a+ w3 o1 N b' x- U弃去上清，MACS Buffer重悬并调整细胞浓度为1×108个/300μL，往每300μL细胞悬液中加入100μL的100μL FcR Blocking Reagent，混匀。再加入100μL 的CD34 MicroBeads，混匀，4℃避光孵育30min。
4 O1 L4 ^* W9 U, s; q5~10mL的MACS Buffer洗涤一次，300g离心10min，弃上清。500μL MACS Buffer重悬细胞。
# s7 u( z* S# I( ?# u( Z5 l5 j2 O将分选柱置于磁场中，500μL MACS Buffer活化分选柱，勿吹打，MACS Buffer不能有气泡，不要加在壁上，应该直接加在分选柱底部。
$ a( V [, B: s/ B3 _待MACS Buffer自然流干后，往往分选柱上加入细胞悬液，自然流干。
! }& c; T8 s4 k5 X9 f' q 500ul的MACS Buffer清洗柱子3次，每次清洗之前要等上次的MACS Buffer自然流干之后加入新的Buffer。
9 {1 Y! a* K- Q+ O3 Z" O 将分选柱撤离磁场并架于15mL离心管上，立即用1000μL MACS Buffer将 CD34细胞洗脱下来并收集。如要获得纯度更好的细胞，可将最后一步洗脱下来的细胞置于新的分选柱上重复8~11步骤一次再次富集。初次富集纯度70~85%，再次富集纯度可达95%以上。分离出来的造血干细胞用于纯度的鉴定、集落形成实验和体外培养等。
& V, @7 C N s$ `' m& X7 y! |脐带血造血干细胞分离纯度的流式鉴定
% O! {2 S _5 [4 s- F- p将CD34磁珠分选后的造血干细胞以3~5mL的预冷的Stain Buffer离心洗涤2次，弃上清，往细胞沉淀中加入Stain Buffer，重悬并调整细胞浓度为1×106个/100μL细胞。# c& G8 k7 G8 ?# ]- b
将细胞转移至2个1.5mLEP管中，每管100μL。分别往两个EP管中加入10μL的FITC Mouse Anti-Human CD34和FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control，4℃避光孵育30min。! h ]) n; r5 h* t8 B
加入1mL的Stain Buffer洗涤细胞，300g离心5min，弃上清，重复3次。往洗涤3次后的细胞沉淀中加入500μL Stain Buffer，重悬细胞并转移至流式上样管中，立即上机检测。
/ u f2 J8 ^) _) y, `+ } U# z6 `2.2.4 造血干细胞集落形成实验
! P( S/ s6 A3 \8 _( `) V4 g将人造血干细胞集落培养基（HSC-CFU Media）置于4℃冰箱，过夜解冻，解冻完后将培养基分装至无菌5mL离心管中，每管分装3mL，分装后置于-20℃保存，避免反复冻融。临用前4℃或常温解冻。) x! a% N' E0 k) H+ G2 ?- P \5 X! S
将MACS Buffer洗脱下来的造血干细胞用PBS以300g×5min离心洗涤一次，弃上清，用IMDM + 2% FBS调整细胞浓度至10倍的接种终浓度。例如，如果要得到每1mL培养基中含有1000个细胞的接种终浓度，则需用含2%FBS的IMDM调整细胞浓度至10000个/mL。根据前期实验摸索的结果，本研究采用的接种终浓度为500个/mL。因此，应将细胞浓度调整至5000个/mL。% f2 v3 `2 [) \4 i6 x) _) J0 v
将300ul已经调整好浓度的细胞加入含有3mL造血干细胞集落培养基的5mL离心管中（细胞体积：集落培养基体积=1:10），立即剧烈振荡使细胞与培养基充分混匀。室温静置5~10min，使气泡充分消散。! @- P- B' w! x1 q) V/ W9 }# V4 b+ }
将16号无菌注射器针头紧紧套在注射器上，缓慢吸取1.1mL含细胞的培养基至35mm的细胞培养皿中，每个5mL离心管中含有的3.3mL细胞和培养基刚好够接种至3个35mm细胞培养皿中，3个培养皿构成3个平行样。
2 [% X; Y7 F2 |6 s( ], c缓慢倾斜并旋转培养皿，使黏稠的培养基均匀的铺满整个培养皿。/ h6 h% f3 d: j
将2个接种了细胞的培养皿放入1个100mm的大培养皿中，另将一个不盖盖子的35mm培养皿也置于100mm大培养皿中，并且在不带盖子的35mm培养皿中加入3mL的无菌水，盖上100mm大培养皿的盖子，置于37℃，5% CO2，湿度>95%的培养箱中培养12天。培养期间注意观察不带盖子的35mm培养皿中水量，注意补水。
5 c x. J L5 P% g7 J培养12天后，在35mm培养皿的底部横竖各画两条线，构成九宫格，利于集落的计数。集落的计数需使用高质量的倒置显微镜，配有10×或12.5×的目镜，2×、 4×和10×的物镜，显微镜需带有蓝色滤光片，以利于观察红细胞集落。 g4 n" p' K) Q+ n% B# Q* ?6 M& [
集落的判定标准如下： y6 ^4 q4 V0 {2 o; v& }# _% `
CFU-E：: 红细胞集落形成单位，可形成1~2个包含有8~200个成红细胞的细胞簇，CFU-E是成熟的红细胞系的祖细胞，需要促红细胞生成素(EPO) 促进其分化。
5 V8 H- F0 w- k3 oBFU-E：爆式红细胞集落形成单位，可形成单个或多个（3~8，9~16，>16）细胞簇组成的集落，每个集落包含>200个成红细胞。和CFU-E相比，BFU-E是更加不成熟的祖细胞，它需要红细胞生成素（EPO）和促爆式活性的其他细胞因子如白介素3(IL-3)和干细胞因子(SCF)，以促进其集落的最佳生长。CFU-E和 BFU-E形态学观察需要在使用蓝色滤光片模式下进行。* B. _0 E# V( F: A2 d! a/ J! L
CFU-GM：含有超过 40 个以上粒细胞和巨噬细胞的集落。可形成含有至少20个粒细胞(CFU-G)、巨噬细胞(CFU-M) 或具有两系细胞(CFU-GM) 的集落。
2 ?; T/ T4 a5 O# U, `3 mCFU-G：是含有超过 40个以上粒细胞的集落。' ~5 h: {* u D
CFU-M：是含有超过 40 个以上巨噬细胞的集落。
- l# B* l5 p6 u& G Q# LCFU-GEMM：粒细胞-红细胞-巨噬细胞-巨核细胞集落形成单位。一个多潜能祖细胞能生成包含有成红细胞和至少其它两系细胞的集落。CFU-GEMM倾向于产生>500个细胞的大型的集落。 |
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发表于 2013-10-14 16:46
