关于细胞复苏后贴壁问题

shuimochunlan

在我们冻存的细胞中有很大比例在复苏后不能正常贴壁或者贴壁率很低，鉴于这种情况，请问要如何改善或者避免上述情况的发生？

uslzhang

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! V: k' X) |1 `$ {$ U$ F( w! o& g" V9 }' z0 x' ~. h0 ~
冻存后复苏本身就是一个重要的工艺环节，需要通过稳定性研究来摸索出适合该细胞的冻存条件，通常有三个因素需要考虑：1.冻存液成分是否适合，2.降温过程，3.冻存密度。

mio

我之前也常常遇到这样的情况，复苏后细胞不行主要还是冻存有问题。我在实验中总结出来的，我的是间充质干细胞，希望对你有帮助。
. K. D6 Z' }9 Z' V! g$ p5 b细胞冻存的细胞生长状态：
6 U8 v6 y/ a/ j; g$ ^5 G3 g) X% K要长势比较好的，不然复苏形态也不好，容易死亡。
$ r+ n6 r- d3 z7 _冻存的细胞数量：, B5 A0 b3 h) ~3 B( U9 K
我觉得一个1ml 一个百万比较好，复苏用T25的瓶，长满比较快，可较快进入实验，冻存细胞数量太多了，密度大，复苏后漂浮的很多。
0 K; a4 S2 k- ~- U1 b冻存液：
6 Y) J0 ^8 n- G7 T8 I; I纯血清+DMSO，有时候看师姐们为节省血清，降低血清的浓度，死很多估计也很正常。呵呵; p6 Y( ^& |& i* I4 j
冻存的梯度降温：6 L2 d; T# K# r% i7 s7 r4 y( ~5 X; q
一定要做到位，细胞适应的过程，4°2-3小时，-20°  过夜，-80°可能保存好几天呢，如果很快就要用，就不需要转到液氮， 但是长时间不用的话，最好还是转至液氮。
! z6 X7 ^/ f6 T- H' r复苏：, g' G6 _: V/ |# ]. C6 R# l
快速解冻，跟着指南走没有错。                5 @4 A6 E# l9 D
3 I; W8 p* C( V+ L
                  

Amanda121201

我是培养MSC的，以前也遇到过这样的问题，除了楼上几位说的那种冻存期间的问题 再就是要非常gentle的去吹打复苏 减少不必要的物理刺激，同样可以达到较好的复苏目的

shuimochunlan

回复 uslzhang 的帖子  r" l" j4 E- W6 `

* J! v9 C! y7 a1 `6 {& u1 Y在我们的操作中您说的三个环节具体来说是这样的；1   FBS 为50%，2 直接放在4℃梯度降温盒内然后转移到-80℃冰箱，两三天后转移至液氮，3  密度最好是5百万/ml,看看我们要从哪个环节上努力？

shuimochunlan

回复 mio 的帖子' f4 `) \" |. U  t, f' [6 _2 D7 V

3 T# _3 }9 h( }5 p3 ], L如果用梯度降温冻存盒的话是不是降温过程就不会这么麻烦了？能不能直接转移至-80℃冰箱？

shuimochunlan

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; l" q0 E% t' l, f1 m
6 J- x* o7 G1 B$ B) M你说的是复苏离心后的细胞重悬吗？但是这个环节怎么改进为‘非常温柔’ 呢？

Amanda121201

恩 多数我们在复苏的时候要离心 去除DMSO的残留 所以 可以将冻存管放置37°化开后 直接放进已加入5ml左右的完全培养基中 然后低速（大约800rpm左右吧）离心 去上清后 再加入培养基重悬 一定要温和 因为有些移液枪的力度比较大 所以要注意 缓慢抽打

SKC-SFC

这个情况主要是以下3个方面造成： % ^- X# `2 i) U* X$ F, Q" U: G
  1.冻存前细胞状态就不好，细胞比较老，冻存复苏后再继续传代，贴壁效果显然不好。至于细胞冻存量不足矣影响贴壁（一般5.0X06没有问题）
+ @! F) X2 s0 A( K1 I) S. S0 X4 W: @  2.细胞冻存液不适合细胞冻存，冻存液成分和加入成分比例很关键
' |5 n4 [4 Z5 `- S! h) M5 T9 x  3.复苏的操作手法和培养基（遵循慢冻速溶的原则，培养基提前预热并选择合适）

SKC-SFC

这个情况主要是以下3个方面造成：
6 P5 f$ J- Y% j* H  1.冻存前细胞状态就不好，细胞比较老，冻存复苏后再继续传代，贴壁效果显然不好。至于细胞冻存量不足矣影响贴壁（一般5.0X06没有问题）5 U: s1 H1 o9 e
  2.细胞冻存液不适合细胞冻存，冻存液成分和加入成分比例很关键
1 j* p9 r1 u0 }) ]8 E  3.复苏的操作手法和培养基（遵循慢冻速溶的原则，培养基提前预热并选择合适）