内皮细胞微环境对造血干细胞调控的研究现状

ag2017

造血干细胞是造血组织具有自我更新和分化潜能的一类干细胞，它可分化为各种成熟血细胞和免疫细胞。造血干细胞生存在包括成骨细胞、间充质干细胞、神经细胞、脂肪细胞、血窦内皮细胞和血管周围网状细胞在内的被称为“龛”的骨髓微环境中。
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尽管造血干细胞移植是治疗白血病等恶性疾病最有效的手段之一，但在临床患者体内单独移植造血干细胞效率低下，而与骨髓基质细胞共同移植可以使移植效率明显增加，可见骨髓微环境对造血干细胞有重要影响。我们就内皮细胞微环境这一主要骨髓微环境对干细胞功能的调控作用作一综述。
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0 Z$ ~0 p" j% j0 U8 i; E8 U6 G1.内皮细胞与造血干细胞的发育：
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20 世纪早期，研究者发现了一种被称为“成血管细胞”的双潜能中胚层祖细胞，它可以产生内皮细胞和造血细胞。因此，内皮细胞和造血细胞的发育被认为是相辅相成的。在胚胎发育过程中，造血干细胞起源于血管周围的一群祖细胞。在哺乳动物胚芽的中胚层，内皮细胞和造血细胞几乎同时出现。8 o- u& @+ R+ c/ G
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这种现象起初是由胚状体的克隆分析观察到的，随后又在体内细胞追踪得到了证实。尽管细胞追踪实验显示有7%和12%分化的中胚层细胞是成血管细胞，但大量的胚胎克隆分析表明同时分化为内皮细胞和造血细胞是一种罕见事件。3 b; f2 Y% f3 d" E" Y+ m
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此外，内皮细胞和造血细胞还共表达一些细胞表面标志物和转录分子，例如CD34、Endomusin、VE-cadherin、CD31（PECAM）以及Runx1和GATA-2。
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近年来，更多的证据表明造血干细胞很可能来源于胚胎发育过程中的“造血内皮细胞”。主动脉、卵黄动脉和脐动脉分离的细胞可以形成大的造血干细胞集落用于有效的移植，而且造血细胞是由被标记的内皮细胞发展而来的。! C/ _* [# B; M& `: |* P5 S

0 n6 E# j' I& @2 u1 D" H3 {Zovein 等用VE-cadherin 对Cre 小鼠主动脉-性腺-中肾区（AGM区）的内皮细胞及其后代进行了荧光标记，随后在胎肝、骨髓和胸腺的造血细胞里检测到大量的VE-cadcadherin荧光信号。
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Chen 等也进一步证实大量的成体血细胞来源于表达VE-cadherin 的内皮细胞。亦有体外实验证明小鼠ES细胞培养得到的内皮细胞可以形成造血细胞。
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, {5 q7 a" O/ a& L; B: NLancrin等监测了活细胞表面分子以及形态的改变，从而推断由内皮细胞到造血细胞的过程。卵黄囊、AGM区以及卵黄动脉附近的内皮细胞均可以支持成体造血干细胞的体外扩增，而其他成体组织分离出的内皮细胞没有这种能力。  }; D/ N' Z- T

4 X& V0 F9 v; I1 o卵黄囊、AGM区以及卵黄动脉附近造血干细胞的存在表明，造血干细胞的存在和造血过程均与血管密切相关。SCL/Tal 是造血系统中非常重要的转录因子，它在急性淋巴细胞白血病中首次被发现，其缺失可造成贫血进而使胚胎在第9.5 天死亡。1 \# e: U* |- a  w3 |
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尽管敲除胚胎干细胞中SCL 可阻断造血细胞的分化而对内皮细胞没有影响，但SCL 表达于FLK1+的内皮细胞，因此可用于确定早期的成血管细胞。4 B7 n8 _5 ~7 e- z1 D
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Lancrin 等提出“成血管细胞”可通过被称为“造血内皮细胞”的中间体分化为造血细胞，在此过程中SCL是不可或缺的。近期，Kim 等进一步证明SCL 过表达可逆转Hedgehog或者Notch 缺失引起的造血异常，维持VE-cadherin+内皮细胞向CD41+造血细胞的分化。& e/ g! C+ m& D6 \6 a; D+ g
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Notch 是一种进化中相当保守的信号通路，其功能对胚胎发育中细胞命运的决定非常重要。Notch 信号通路靶基因Hes1 在主动脉弓内皮细胞和造血亚群广泛表达，而Hes1 缺失并未造成造血异常。  q) w- V$ q6 ?: {0 w) }# G

, \; {+ ?9 u5 l7 e" NGuiu 等提出Hes1 在小鼠胚胎干细胞发育的过程中非常重要，AGM区Hes5 基因的过表达可消除Hes1 缺失引起的造血异常。Hes1 和Hes5 双基因敲除造成小鼠的动脉系统发育缺陷、大量无功能的祖细胞出现、干细胞缺失、Notch 靶基因Gata2 上调。4 G/ D8 J" r' \) U+ u: z
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此外，Runx1 和Notch信号通路转录因子在内皮细胞到造血干细胞的发育过程中也起了关键作用。Richard 等发现Runx1 在造血内皮细胞高表达，而Notch 低表达。抑制Notch 信号通路可以提高小鼠和鸡胚胎造血细胞的产生。
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+ E8 o4 L+ p( y' f0 w: `Notch1 缺失可使AGM区造血功能异常，而其活化还可以激活胚胎中VE-cadherin+的亚群并选择性阻断造血干细胞的产生和胎肝造血。上述研究说明，胚胎发育过程中骨髓血窦内皮细胞和造血干细胞密切相关。
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2.内皮细胞对成体造血干细胞功能的直接作用：5 v$ p" T# j  x  v
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Knospe等早期的实验证明造血重建和内皮细胞再生相关。骨髓血窦内皮细胞对放射非常敏感，在亚致死剂量照射后的3~4周内皮结构可以重建；而超过20 Gy则不能被修复。
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, u/ @4 V. I; R+ `2 _) hRafii等提出原始的人骨髓内皮细胞可以产生多种细胞因子并支持体外人CD34+细胞的增殖和分化。Davis 等发现猪脑血管内皮细胞系可增加人骨髓CD34+祖细胞的数量，这表明非造血组织的内皮细胞可以支持造血干细胞的体外扩增。
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; C6 V5 j: K. D( y* @后续的实验证明猪脑血管内皮细胞还可以支持非人源造血干细胞的体外扩增。成体内皮细胞分泌的可溶性细胞因子可促进小鼠和人骨髓抑制后造血干细胞的体外扩增和再生。
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: m' v$ w2 f( Z& J1 o6 L注射自体或者异源的内皮细胞可以促进放射后的造血干细胞恢复和重建，而给予VE-cadherin 抗体可抑制骨髓损伤后的血管新生和造血重建。
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- T, {8 t6 b0 n( _6 UHooper 等发现骨髓血窦内皮细胞共表达VEGFR2和VEGFR3，而Sca-1 表达缺失。VEGFR2小鼠在接受全身照射后骨髓血管再生和造血恢复受到明显抑制，注射VEGFR2抗体也可以抑制造血干细胞的恢复。/ G, v" X% ~, ^% ]

$ i- ~4 n) r6 R; g因此，VEGFR2+的血窦内皮细胞是放疗后造血干细胞恢复所必需的。Doan等证明Tie2+骨髓内皮细胞可以调节放疗损伤后的造血干细胞再生，其实验建立了敲除BAK和BAX的Tie2+内皮细胞和造血干细胞模型，与野生型相比，这两种模型在受到致死剂量照射之后造血功能可以完全恢复。这些实验表明内皮细胞对造血干细胞维持和再生有重要作用。
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8 V0 \/ Z! _0 X0 w3.内皮细胞分泌型细胞因子对造血干细胞的调控：5 _& Q* m8 e4 Z) n

: h+ }, y7 b$ g$ b: Q2 y3 `' A血管内皮细胞可以分泌大量影响造血干细胞转移、归巢相关的重要细胞因子，例如SDF。2006 年Yeoh 等首次提出原代人内皮细胞（PEC）在造血过程中的调节作用。% @) e- Y1 k' u' t/ c! Q6 w: E

4 B) N# z9 U/ Y' J, O. L他们的研究表明血清和促血管生成因子可以抑制细胞自分泌对稳态的支持作用（VEGF-A和FGF2），为维持PEC 的状态以及与造血干祖细胞（HSPC）的共培养提供基本条件。
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为了进一步研究以上问题，Seandel 等建立了一种研究血管微环境的模型，其内皮细胞可以维持其长期的成血管能力而不癌变。他们将E4ORF1 的腺病毒基因转入人原始内皮细胞，导致Akt的活化从而获得永生能力。
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# O0 w  t: y: q* n* a) WE4ORF1 转导的PEC 通过分泌维持小鼠KLS细胞自我更新需要的使干细胞活化的成血管因子，在体外促进造血干细胞扩增。成体小鼠内皮细胞中Akt 的选择性活化可以通过上调一些造血干祖细胞自分泌因子而增加造血干细胞的数量、促进骨髓抑制后的造血恢复，例如FGF2、BMP4、Ang1、IGFBP2 和DHH，而抑制性因子的表达可使其水平降低。
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Akt 和有丝分裂原活化的蛋白激酶共激活可维持造血干细胞池的稳定，并支持特定的祖细胞分化。近年来，我们通过显微计算机断层扫描、组织形态测定以及空间分布检测等新技术观察到骨、血管和造血干细胞的空间关系。
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$ H. W: T0 y% d( P/ h透明质酸是内皮细胞表达的一种重要的黏附分子，它对造血干细胞移植后的跨内皮转移是不可缺少的。有证据显示包括骨骺和骨干在内的所有细胞都在距离血管3 个细胞直径的范围内，进一步证明这些细胞很可能会受内皮细胞分泌的细胞因子的影响。
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Zheng 等提出骨髓血窦内皮细胞和间充质干细胞样细胞高表达可直接影响造血干细胞的糖蛋白，如Angptl-3。Angptl-3 主要表达在与造血干细胞相邻的骨髓血窦内皮细胞，它对造血干细胞干性的维持非常重要。Angptl-3 缺失的小鼠造血干细胞的数量和静止期的细胞比例下降，造血干细胞移植后的重建也被抑制。$ _$ s1 W) S5 u8 ?% r7 n

3 o/ k* C$ U2 L) s) g& ~) y- e综上，这些新技术的应用进一步明确了内皮细胞分泌的细胞因子可通过旁分泌作用影响临近干细胞的生物学行为。$ b, |& A! g+ n( h3 _9 t

1 P: G. _9 V7 @) ]4.内皮细胞膜型细胞因子对造血干细胞的调控：
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造血干细胞在移植后的归巢过程需要一系列的分子间识别和作用。造血干细胞表面的黏附分子VLA4（CD49d）、LFA-1（CD11a）和CD44（HCAM）分别与骨髓内皮细胞表面的VCAM-1、ICAM-1（CD54）、E-选择素和P-选择素（CD62E和CD62P）相结合。6 }6 x; s' B: t% z. x

, q4 A. d; B! `- I& V在这过程中，Notch 信号通路的跨膜受体1、3、4 与膜结合配体Delta1、2、4 结合发挥作用。配体结合后蛋白酶诱导Notch 受体的裂解，使NICD 转位到细胞核内激活Hes1、Hey1和Hey2的表达。
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3 ?7 ^3 E! e3 H9 y+ \Notch-1 在长周期造血干细胞（LT-HSC）表面表达，它对维持造血干细胞的未分化状态有作用。Notch 细胞内结构域的过表达可以增强造血干细胞的自我更新，而其缺失可使造血干细胞功能受抑制。. J9 V; o2 `% C# N
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Butler 等通过阻断血管生成的信号通路，造成Notch 配体表达水平的下降并抑制LT-HSC 的扩增。Notch通路还可调节造血干细胞的自我更新或分化,将富集的经Notch 配体处理的造血干细胞进行体外培养，其结果表明Notch2 可以抑制髓系分化并促进原始Sca-1+c-kit+祖细胞的产生。/ E: E- z0 G* G" x2 ]% x+ O4 C2 e
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在造血损伤后的小鼠体内，Notch2 可促进MPP 和LT-HSC 的产生而抑制髓系分化。而一旦达到造血稳态Notch1 和Notch2 将不再发挥作用。
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6 z3 I2 @0 O3 B! u4 y$ _Ingrid 及其同事最近发现，在骨髓血管微环境中，E-选择素还可以通过非E-选择素受体介导的通路来调节造血干细胞的休眠、自我更新以及化疗抵抗。
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* {. D5 e. d" h* o6 y5 RE-选择素敲除或注射E-选择素拮抗剂的小鼠造血干细胞的增殖水平提高，且用化疗或放疗处理这些小鼠后其造血干细胞增殖水平可提高3~6 倍。因此，骨髓内皮细胞微环境中的E-选择素有放疗或化疗后的造血干细胞保护作用。& n( K& g" w& C
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Ding 等提出内皮细胞可以合成关键的造血干细胞调控因子——SCF。当用Tie2-cre 小鼠模型删除内皮细胞中的膜型SCF 后，造血干细胞的数量明显减少，这说明膜型SCF对造血干细胞的维持是必不可少的。
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当然，骨髓内皮细胞表面SCF的表达水平要低于血管周围网状细胞，这说明骨髓外内皮细胞有可能对造血干细胞的维持也有作用。内皮细胞与造血干细胞空间上相邻以及多种内皮细胞表面因子与造血干细胞的相互作用均表明血管微环境对造血干细胞非常重要。
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3 u) Y2 e% f7 v5.内皮细胞微环境与白血病干细胞：
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" Z4 g3 y% a/ `. R; ^- v急性髓系白血病是一种常见的干细胞分化异常的白血病，尽管初期治疗对60%~70%患者有效，但大部分患者仍然死于这种疾病，这可能是由于小部分可抵抗化疗和药物的白血病干细胞造成的。/ I1 d4 A- W' ^- G
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白血病发展的过程中，微环境也提供了使细胞向某一特定方向发展的信号。在白血病患者中，正常造血干细胞减少，骨髓微环境异常。注射高剂量的阿糖胞苷后，白血病细胞群黏附到血管表面，这为白血病的研究提供了很好的模型。: \% J! q: \3 r) r3 N5 x! s
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CD44 是一种透明质酸受体，它对造血干细胞和祖细胞归巢到血管微环境有非常重要的作用，Krause 等近期研究表明，CD44在BCR-ABL小鼠的白血病干细胞中高表达可以促进干细胞归巢并提高E-选择素配体的功能。
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在小鼠逆转录病毒构建的CML模型中，CD44突变供体中BCR-ABL1诱导的祖细胞其归巢能力缺陷，CML不能发病；而用空白对照逆转录病毒处理的CML模型中，CD44 突变供体中BCRABL1诱导的祖细胞其归巢能力正常。在以上AML和CML两种模型中，CD44中和抗体均可抑制白血病干细胞的归巢，减缓白血病的发病。
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疾病状态的内皮细胞微环境对白血病细胞的增殖和发展有促进作用。在AML患者中，内皮细胞对白血病细胞起到了保护作用，同时白血病细胞促进了骨髓中的血管新生。VEGF和Notch 信号通路在调节胚胎血管发育和肿瘤血管生成中是一种主要因素。
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VEGF 作为一种低氧诱导因子可以促进血管新生。它在表达VEGFR2的患者体内可通过自分泌和旁分泌发挥作用。血管新生对AML的发展和化疗敏感性有非常重要的作用。AML细胞可以分泌大量的血管调节因子以刺激内皮细胞增殖并诱导血管新生。
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+ N/ D6 X. s& b9 W' BZhang 等对内皮细胞和AML 之间的相互作用进行了研究，他们发现新发病的AML 患者骨髓血管密度、VEGF、VEGFR2、Notch1、DII4 以及Hes1 表达均增高。AML 细胞可促进内皮细胞的体外增殖、活化Notch/DII4 信号通路同时增强其细胞转移和管状形成能力。
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& K* X2 ]5 G3 f# |4 B3 _此外，低氧环境还可以促进大量细胞因子的分泌，包括IL-6、IL-3、G-CSF、GM-CSF和一氧化氮，从而促进血管的新生和白血病细胞生长。综上，内皮细胞对白血病的发展有重要作用，并可影响白血病的进程和治疗效果。
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本文我们概述了骨髓内皮细胞微环境对造血干细胞的发育及功能影响的研究现状。虽然近期研究结果对了解骨髓微环境调节造血干细胞的机制有所贡献，但骨髓内皮细胞对造血干细胞维持和再生的调节机制仍有待深入探索，特别是内皮细胞与其他多种微环境细胞成分的协同作用还不甚明了。
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" }6 _/ m; J3 O0 Z此外，进一步了解骨髓微环境、造血干细胞、白血病干细胞三者间的相互作用机制，对进一步阐明造血干细胞生理调控机制、提高造血干细胞移植效率以及探索白血病治疗新方法有重要意义