做过质粒提取、纯化和动物细胞转染的进来

zhen022

1、目前质粒提取是用的OMEGA公司的小提试剂盒，不过研究用的基本浓度是1mg/mL的量，这得提多少次才够用的啊！！！！有没有做过觉得性价比高的推荐？* o( e  k4 ~) M+ u8 E
2、这个质粒提取后，内毒素对转染效率影响很大，内毒素有没有简单的检测方法?一般测量OD260/OD280,看大于1.8就可以了。在体质粒时候使用的菌液量过大会不会导致后面获得的质粒纯度不高，混合蛋白和基因组DNA，甚至是高浓度内毒素？在提取后TE溶解的质粒如果浓度不够或者内毒素高，如何进一步纯化，有没有可提供的文献？: q/ K. J: ?- F+ G
3、有没有比较高效，但不用试剂盒，可以自己直接配，大量生产的方法？
+ u$ H: W/ ?6 q. d

xiangchou812

最简捷的当然还是用质粒大提试剂盒了。可以买五或十次小包装的。菌液量超过试剂盒推荐量太多导致裂解不完全肯定会影响质粒提取的质和量。真心要自己配液的话可以翻翻分子克隆实验指南。不过要做转基因连大提试剂盒的钱都要计较的话，后面试验可能更难开展。

jiaozi

1,用qiagen的大提质粒试剂盒；
# r# d. e, p; k0 A; Z. L7 ~2，按照大提质粒说明书操作，注意量，内毒素一般不会超标，可不用考虑

CoolCell

为什么不用大抽试剂盒呢？100 ml菌液，一般大抽试剂盒一次可以提到0.5-1mg，够你做十几次几十次转染了。国产试剂盒也可以啊，性价比高，可以试试天根或捷瑞的，抽一次也就几十人民币。至于内毒素大抽试剂盒有去内毒素的功能。

whs1230

我们lab用的是invitrogen的中提试剂盒，默认的内毒素free。中提浓度基本可以达到3000ug/ul，100ul ddH20溶。高的时候能达到8000+，提一次足够你用的了。实在不行可以换大提（我没用过）。+ y, E# ^6 ^7 l9 \* ]. u
关于内毒素的问题，国产抽提试剂盒很少可以去内毒素，即使抽提过程中加入了去蛋白液之类的东西，因为国产试剂盒几乎都是用低成本的硅胶吸附柱，进口的有的是用的离子型吸附柱。如果要严格控制内毒素抽提转染级别的质粒的话还是用进口的比较好。" ]4 j  o: n  {4 Z! L
不用试剂盒的话，可能只有用异丙醇之类的试剂抽提了，效率和纯度一般都不如kit高。* s6 p% }  |2 \/ B3 @
抽提时候如果菌液量过大最伤心的是因为裂解不充分而极大降低抽提效率，所以还是根据质粒拷贝数和kit推荐菌液量适当调整。关于基因组污染只要注意操作的时候动作不要过于剧烈就没有问题。0 r" b3 L/ z8 S* m  e4 N* K

jiaozi

回复 whs1230 的帖子( C. h9 p# N" }8 F4 `$ N0 ?
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中提试剂盒能提出3000-8000ug/ul?100ul溶解，你提一次可以提300-800mg质粒，这不可能吧

whs1230

回复 jiaozi 的帖子, o: w& `$ @" b" |& \

7 r9 ?0 _! a4 P' B$ w) j. s额，不好意思，写错了，是3000-8000ng/ul.（Nanodrop测得浓度）也就是3-8ug/ul.抽提一次可以达到300-800ug。
$ m# c5 g$ G# }/ \( y大提试剂盒可能就更高了，我们隔壁有lab在用。
1 O: ^# t* n8 X+ j' W5 F' I抱歉，由于我的疏忽！

weiyepan

看你们这些数字真欢乐，DNA浓度有3000ng/uL以上就粘得不得了，能洗下来8000的我真没见过。。。还有100mL能提1mg的高手。。。同学们你们怎么定的量啊，分得清RNA和DNA么？

rexhz

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7 I8 }- D( o( m* e) W& t, e% B/ J: S, J3 k% i& G) A
洗下来8000指的是 用QF从柱上洗下质粒，然后用异丙醇沉淀，后面加水溶的。

weiyepan

回复 rexhz 的帖子- o1 n* h/ T  t$ d

9 i  c' G2 ^" ^2 v" G+ l9 R3 [4 Y给8ug质粒你，自己溶个1uL看看溶不溶得掉？