求助，脐带间充质干细胞培养中逐渐死亡

听不到

复苏脐带间充质干细胞后长了大概80%之后传代，0.05%胰酶（加了EDTA）消化，大概消化了15min，还是挺多细胞没下来的，后来是吹下来传代的。没有离心去除EDTA（师姐说不用去，因为EDTA量很少），直接传代。因为细胞量少，就多养了几天，传代后第三天看细胞长得挺好，都贴壁了，而且状态也挺好，就是漂浮着一些黑东西，不知道是什么，就直接用PBS洗了洗之后换液了。然后今天是第六天，看细胞的时候发现细胞都死了，大团飘起来的黑东西，只有极少数细胞贴壁生长，形状也变成了宽的，感觉特别奇怪。2 H. P. X9 v% }3 L
分析原因可能是没去除EDTA的原因？或者染菌？开始还怀疑过时消化时间太长，可是第三天的时候细胞长得挺好啊，愁死了！！求助！！！

stefsue

可以考虑下染菌的问题，拿培养液送检做个培养吧

Amanda121201

你放在高倍镜下观察 估计会看到可以动的小小的黑色的条状生物 我们管这个叫做黑胶虫 黑胶虫繁殖很奇怪 起初基本没有任何征兆 会突然间大量繁殖起来；还有一种状态就是 细胞状态很烂 没有明显的染菌状态 怀疑是支原体感染 你可以看一下

听不到

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那么胰酶消化时间和EDTA去除与否在我这个情况中可以基本不予考虑是吗？主要考虑的就是染菌？

Amanda121201

干细胞对于胰酶的残留是很敏感的 过多的姨妹残留会影响其生长状态 建议一定要再重悬一下

孙帅帅

1、你的消化时间真的很长，我不知道你们用的什么胰酶，但是我们一般37℃，消化1min，轻轻拍一下培养瓶，细胞基本上就都掉下来了。0 f8 W. [6 {+ Q/ x
2、建议你还是缩短一下消化时间，不用把所有的细胞都消化下来，浪费点就浪费点吧，e酶会影响细胞状态。
  G( q- V( X# C2 `. Q; k- k1 t3、你们不用含血清的培养基终止消化吗？
2 N$ C8 n- c! k4、如果你养多了间充质，你就会发现间充质干细胞非常不喜欢e酶，但是如果你是做科研，就无所谓了。3 n1 |  s* q8 |0 U6 v  P3 @1 R0 A
5、建议你还是重新做一根脐带，如果还是那样就要考虑所用的试剂是不是有问题。关于到底是不是黑胶虫或者支原体不好确定，也不必深究，把你的细胞养好了就行了！

月_幻影

先检个菌吧，也不排除支原体感染。

一转身的距离

被间充质细胞15min的消化时间吓到了！没有照片，不好判断是不是污染。

lizzy_81

胰酶消化，室温超过15分钟，对细胞都是有损伤的，不知道你的消化温度是多少。
: [* q) b3 V, P- h! l( J/ p+ z& V: @% F" v3 H
黑色的东西是显微镜下看到的吗？有时死细胞都成团了，也有点发黑。
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menghy

长满80%消化用15min，时间确实长了，需要考虑消化的影响，消化时间过长对后续传代有很大影响，几代后就可能衰老死亡了。
1 v  {. l6 C; w* {" _2 s# m* X这个应该是污染了，查一下支原体看看。