南大黄行许解决CRISPR的脱靶问题（附原文）

yinfuhua

1 u+ m' r, o; P. [+ \0 I6 O

3 T1 O8 d* H4 T) X南大黄行许解决CRISPR的脱靶问题
" |' p7 Z+ g( t( L  [2014-03-06 1 来源：南京大学模式动物研究所 作者：潘德京& D9 \. Q+ p7 q7 O, R8 E1 S: J

* [1 A5 i& T& @7 d南京大学模式动物研究所黄行许课题组和英国Sanger研究所 Bill Skarnes 课题组开展国际合作，利用Cas9切口酶和成对sgRNA，能够高效突变小鼠基因，并且大大降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应，《自然-方法》(Nature Methods)于3月2日在线发表了这一研究成果。
- {# e& b. X* b/ _- L以《应用CRISPR-Cas9切口酶进行最小脱靶剂量的基因组改造》（Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects）为题的论文第一作者为南京大学沈彬、Sanger研究所张文胜博士和南京大学张军，Sanger研究所Bill Skarnes教授和南京大学黄行许教授是该论文的通讯作者。这是黄行许课题组继上个月在《Cell》上发表文章后再次在高影响力杂志上发表他们的研究成果。
& c2 z8 k" U0 L  aCRISPR/Cas9系统虽然能够高效突变基因，但其脱靶效应妨碍进一步应用，特别是临床应用。为降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应，研究小组通过改进CRISPR/Cas9系统，利用Cas9切口酶和成对sgRNA（图1），通过注射小鼠受精卵，在不降低基因突变效率的前提下，可有效降低CRISPR/Cas9系统的在小鼠基因组上的脱靶效应。成对sgRNA的选择比较关键，两条sgRNA结合不同的DNA链，其PAM序列要以尾对尾（tail to tail）出现，并且两个sgRNA结合的位点不能相隔太远，Cas9切口酶会在每个sgRNA结合的地方造成小小的单链切口（SSB），两个相邻的单链切口会形成一个DNA双链断裂（DSB），DSB的形成会激起细胞以非同源末端链接（NHEJ）的方式进行修复，该过程中会引入插入、缺失或者突变（图1）。而在潜在脱靶区域，单个sgRNA造成的SSB会通过碱基切除修复方式精确修复该区域，不会引入突变。该合作课题组通过该技术同时敲除三个小鼠基因（包括Rag1和Rag2），同时提供了免费的在线资源序列查询网站。研究结果说明这一方法可以应用于其他物种的基因组改造，并显示出临床基因治疗的应用前景。
# z% K$ G6 T, I1 K6 F* M4 C
# v. R/ H% g$ w+ d3 |" k7 v% n( [图1： Cas9/Paired sgRNAs strategy
+ G. O$ C  |, U: |5 B3 j& _5 f' E. Y该课题研究得到了国家基础重大科学研究计划项目（2010CB945101和2011CB944301）和英国 Wellcome Trust 核心基金的资助；沈彬得到南京大学优秀博士研究生创新能力提升计划资助。
( V& p9 v& ^, q延伸阅读：( N4 ^: r/ f/ c3 b9 P
Cell：里程碑成果！中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴) X7 f& H8 C+ X& T2 x7 u4 q. O
原文检索：; @  f- \0 {; L/ k+ q
Bin Shen, Wensheng Zhang, Jun Zhang, Jiankui Zhou, Jianying Wang, Li Chen, Lu Wang, Alex Hodgkins, Vivek Iyer, Xingxu Huang& William C Skarnes. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods, 02 March 2014; doi:10.1038/nmeth.2857
* F  X: F! O" @1 ]
, G$ u$ [) }+ C- U' d# i
8 H  C  n4 l- W, S" M/ g' T2楼原文 感谢songzxj 提供

sicy

求原文，非常感谢！

songzxj

yinfuhua

回复 songzxj 的帖子
" K$ R7 `5 ^3 o: Q
1 V& Q. N* _: T! R/ G  h) Y, B; y谢谢提供原文。

fengqingrusi

很不错的设计思路。