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首先胎鼠日期的确定：头天下午五点左右合笼，第二天早上九点分笼此时间段即为0.5天。1 V+ q6 b) a2 Q5 ~) a, z4 H
细胞分离过程如下：取得部位大致为cortex，脑膜及cortex表面的膜取得较为干净。基本上可排除红细胞的残留。, B$ e! _1 A& ?) H
准备所需试剂：CMF-HBSS，Neurobasal，B27，10×Trypsin，100×DNase，200×TI
# O/ y; x {/ {2 z7 T准备E12.5~E14.5的胎鼠。（一般一只孕鼠，即可）& V0 Z+ U: \1 d! b+ X7 k
在解剖镜下分离E14.5胎鼠端脑（皮层），放置于含有预冷的CMF-HBSS的35 mm dish。: q0 M( M9 a, Z' k- d% d4 ]# i
在超净台中，小心将35 mm dish中的CMF-HBSS吸干，再加入2 mL的CMF-HBSS洗一次，最后用1 mL的枪将CMF-HBSS连同分离的端脑转移到15 mL离心管。. S z: K# q& ?" X
再用2 mL CMF-HBSS洗两次。
* N5 F. b& K/ V0 O" B! L吸走最后一次洗的CMF-HBSS，再加入1 mL CMF-HBSS，之后加入等比例的10×Trypsin (1:10，0.1 mL)和100×DNase (1: 100, 10 μL)，37ºC水浴放置10分钟, 每隔2分钟摇一次。5 f9 K1 |% `; S
加入按1:20比例加入1%TI（Trypsin inhibitor，Stock 1% in CMF-HBSS，50μL），混匀后800 rpm, 3分钟。
- N. G: i ?' m9 @: s弃上清，加入2 mL Neurobasal medium（NB）洗一次，800 rpm, 3分钟（重悬但不必吹散细胞）。6 V0 M& d- ?4 }2 A
再弃上清，加入3 mL NPC culture medium (NB+2%B27+20 ng/mL EGF+20 ng/mL FGF)，用1 mL枪轻柔吹打混匀20次，静置2分钟后，转移上清到另一新的15 mL管中。静置2分钟，再转移到新15 mL管。取出10 μL加入到含有90 μL NB的EP管中，混匀后，计数（1:10）。: Y4 p0 J: i/ E, c* q/ }1 p* {
按1×106/ dish的密度种到60-mm dish或T25 flask中，第3天即可观察到明显的神经球形成。
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5 r7 o8 O0 g5 P2 s% Z% x* t2 ?希望大家能晒出自己的protocol，相互借鉴。, V4 X3 y! F; F- ~5 v
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发表于 2014-5-22 22:17
