请教老师们一个关于脐带间充质干细胞培养的问题

cloud100

各位老师们好！
, J. Q, A  n; V% b7 ?    我是一个细胞培养的新手，想请问几个hUC-MSCs培养的问题，谢谢指教！
3 K6 e: O% y( P7 W8 n: g    我的计划培养步骤是这样的：: o+ P& u* R' \" |9 U5 {5 V
1.脐带放到运输液（DMEM/F12培养基）中，4°保存，24h之内进行处理；
* f; _( S; }- `* d+ j: C% Y' \2.超净台中，取出脐带，剪取1CM长的小段，PBS洗净脐带血块，70%乙醇浸泡30s，然后PBS再次洗净乙醇；
- w' H4 k& b; ?5 o; S3.用解剖剪及解剖镊分离出2根脐带动脉，用解剖镊撕下脐带羊膜和脐带静脉之间的华通胶组织，剪成1-2mm小段；
: Q. j# s& I2 F0 P3 @4.取T-25 NEST培养瓶，瓶底用FBS湿润，将组织块用巴氏管小心种到瓶底，间隔1cm，每个瓶子大约种下20个组织小块，一次培养3个瓶子的组织块；& t) y/ ~* F& f2 k: _' ^: u3 h  J% D/ a
5.将瓶底朝上，放到37°、5%CO2 的培养箱中，倒置培养过夜（培养12h以上）；* L+ D" i: x8 m! z2 }" Q( @
6.过夜后，沿着瓶子侧壁，小心加入完全培养基（10%FBS，90%DMEM/F12，双抗---100u/ml青霉素+100mg/ml链霉素）3ml，瓶底朝下、继续培养箱中培养；. p* [9 N) t! I2 J( h: I
7.前三天不要移动培养瓶，第四天开始观察瓶子组织块有没有细胞爬出，培养基是否变黄、需要更换等等。。。* A5 l4 K0 Z) f( S5 e& P, q
我的问题是：$ H- o, Y2 a% ~
a：以上步骤有明显错误吗？/ v8 W9 g0 Q$ R1 v: r* |
b：完全培养基配置时，必须0.22um滤器、过滤除菌吗？
$ U4 R6 n3 t# L8 ^) n. I8 K9 nc：文献中大多有添加谷氨酰胺，但我发现自己买的DMEM/F12中本身含有2.5mM的谷氨酰胺，那我配制培养基时还需要另外再添加谷氨酰胺吗？/ O! g4 P$ a0 F) H2 [: |
谢谢各位老师的指教！！！

yaolinzhang

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: H' |3 l1 h% Q8 W8 i
( |; j) }, L/ h! ~7 c+ p0 @1.我们一般用酶消化法，楼主注意无菌操作，避免污染，另外掌握好培养时间，及时观察细胞；/ X* Q4 D. D8 j" w$ h5 d9 l: ^0 l
2.在无菌操作前提下，鉴于加了双抗可以不用过滤；
. i: h7 N; C; B3.至于谷氨酰胺，原则上不用添加，但我们一般加一半；

cloud100

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% R* a- h6 ]4 q% l" x. F8 }* V
+ i6 T9 {4 a2 H8 \$ W8 M* R) i谢谢您！我还想问下您，您说添加一半的谷氨酰胺，是多少浓度的？我买的DMEM/F12中有2.5mM的谷氨酰胺，依照您的经验，需要再另外加吗？

yaolinzhang

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$ V& V* r, x7 X* \
/ d4 U2 Z( X% a可以不加，若加按0.5%

thor0504

回复 cloud100 的帖子5 }3 J% L% o0 q- C

. Q0 s% F* `7 d4 l1 g, M楼上回答的已经比较完备了，不过我们也是用组织块法，细胞爬出时间一般会稍长一点，建议如下：
) o/ @9 L1 T. Q- Y. h1 c1、在培养箱中静置的时间可以长一点，第5到7天再观察就可以了，组织块贴壁法一般7天爬出细胞就算比较快的了，静置时间长一点有助于细胞的贴壁生长。4 W9 s* f; G! B7 |- U
2、7天后第一次换液就差不多了，25的瓶子3ml不算少。
3 W# ~- f& P% }& g& k3、我们培养最小用的是T75的培养瓶，25的瓶子加3ml是刚好没过组织块吗？刚好浸没就可以了，P0时候的培养基不用太多。

cloud100

回复 thor0504 的帖子4 F6 V2 r" {4 y# q% \0 z  [

" c- f- `  _  R! D* @& U好的，谢谢您的耐心指导！！

thor0504

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9 P% ?2 t( f0 c
( S- T* m( H! _7 C0 @呵呵，客气了，有空多交流

yanglixia

瓶底朝上，放到37°、5%CO2 的培养箱中，倒置培养过夜（培养12h以上）这一步是什么原理呢

细胞海洋

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+ w% a  k' z% ]. Q- N; W. ]
( }7 U/ r" B9 |
- m$ c' e4 @6 u1 z你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样! b% a* d3 O+ h" a
1 }( m$ i, F$ {, Y/ ]8 r
否则他会看不到8 ^) t& ~' y( A6 C: H/ K% Y  i5 a

zhangjieyctc

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! u! D) s& p) Q" H; S% m
4 C1 u* W# Y% L不需要倒置，剪好后直接加培养基培养，不要移动，5天换一次液，大概10-12天左右就能传代了，一般培养基里都有谷氨酰胺的，如果短时间用不完的话可以适当添加一些或者加一种谷氨酰胺替代物