流式分选后继续培养细胞

dwfrost

我最近做GFP转染实验（用的lipo2000），将含GFP的质粒转染到细胞之后，第二天用流式分选GFP阳性细胞（阳性率大概3%），想继续养分选后的细胞，但过一天再看时细胞都没有贴壁的。我怀疑是流式对细胞损伤太大了！因为做分选的老师收到的反馈很多都是不贴壁的。请问有人做过分选后培养细胞吗？能分享一下成功的经验么

dwfrost

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分选前盛细胞的培养液是无血清的，收集管中是正常的含血清的MEF培养液，是不是有浓度差就ok了？收集管规格是5ml，收集管中培养液是4ml，这个应该没问题。

dwfrost

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1.我们这边做流式是有专门的老师操作的，她也说是无菌操作，但我问了分选后成功贴壁的只有肿瘤细胞。
! Y+ f& D, ~4 j/ [' b# r& |2.阳性率这个是低了点，成纤维细胞不像ES，转染效率是比较低，机器显示最后得到的细胞数是3万多个，我后来就养到24孔里边的。结果离心可能没完全离下来，重悬后的细胞特别少，估计就上千个。6 y) V& h" F/ V6 P
3.“润湿”这个没注意，谢谢你的提醒。& X' T2 |1 w# l- A
4.分选前后细胞是放在冰盒上的，至于机器温度，我再问问。0 Q2 ]( W& i' l  G, W" _( O9 i
5.分选前是镜检过的，有GFP阳性细胞，虽然不多，但可以确定是有的。细胞状态是贴壁状态的，看着还好。和今天飘起来的比，简直太明显了。

dwfrost

回复 shaozi402 的帖子
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; r% J' M8 j# j  i; u我做过两次了，最后都漂起来了，纠结中……

dwfrost

回复 luyue6453 的帖子* w* U. d" p, C9 k

- M: E+ \* k, r9 X6 ^$ V! u这个就是GFP筛选。用抗性基因筛的话选感觉浓度把握不好，还有就是瞬时表达怎么控制筛选时间？双向摸索中……

dwfrost

回复 shaozi402 的帖子! \& {4 u+ p0 E- ?1 V& w
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分选后也能看到荧光，就是养一天后细胞全死了，急死人