关于在MEF饲养层上的小鼠iPS的RNA、DNA、蛋白提取的问题

zhd0506

复苏的小鼠iPS到小鼠胚胎成纤维饲养层上，现在生长状态良好，请问如何提取才能获得更纯的克隆的RNA、DNA、蛋白？因为克隆是小鼠的饲养层也是小鼠的，所以怕是同种动物细胞会污染克隆的RNA、DNA、蛋白。现在想得到更纯的RNA、DNA、蛋白。' g+ `6 N# g8 n2 D% R$ \5 j
1）我现在只知道用差数半个小时的方法去除饲养层，还有没有更好的方法？% C# P1 ~7 L0 Y! A
2）如果不用饲养层培养，复苏时候用Feeder-free培养基直接复苏可以吗？- d6 e/ y( u# K8 [
3）Feeder-free培养基用大家推荐用哪个公司的？具体名称是什么？培养基贵不贵？

zhd0506

回复 孤野知—少帅 的帖子5 d: v9 Z' N' Q
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你的还好吧，毕竟是两种物种，用差速的方法就行了，提取的DNA和RNA在做PCR之类的实验时候引物不结合小鼠的。而我的是同一物种，DNA和RNA是一样的，污染相当大。流式的话我们实验室还不具备条件，我们只能做分析不能分选

zhd0506

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你们用过Feeder-free培养基吗？

zhd0506

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% i# Q, J* b, B: [/ W: a- q6 W差速分离，简单说就是把带有饲养层的克隆整体消化下来，离心，弃液，加入培养基放于空皿或者空培养瓶中培养半个小时，在用移液器吸取培养基至离心管中离心（此时皿中的饲养层半个小时大部分基本就贴壁 了，剩下的克隆还悬浮在培养基里，可以将皿扔掉了），接下来就可以直接进行DNA和RNA等的提取了。

zhd0506

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嗯，约半个小时你会在显微镜下看到贴壁的MEF，飘着的散开的iPS，具体效率没有算过，分离后就直接提取DNA、RNA等了。你可以试着看看效率如何，我当时是在显微镜下看到大部分MEF都贴壁了，还有有就是不一定是半个小时，你可以根据你自己的细胞调整时间，半个小时是我们实验室自己根据细胞总结的。

zhd0506

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# y# y3 A% r( j" f/ R" v/ W0 J# |) H4 E( k8 F( `
:P你说的很对

zhd0506

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) e% T6 U( \- M不客气