【新人求问】求 H1 细胞怎么鉴定，求分享

缥飘实验员

最近在养 H1 细胞，老板说鉴定一下，完全是0 啊  求大神相助

shaozi402

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3 U. [% A# U, J. X  ^0什么意思，是如何鉴定H1吗？用人胚胎干细胞的标记进行鉴定，比如说noggin，SSEA4等

缥飘实验员

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* L+ _" k# b/ s; y2 t
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+ E3 i6 f9 d1 I0 x) n: v: x. _( b* t4 P- N" V$ J4 R! b5 a2 z
老师好，现在刚刚接触 H1，零经验。现在查到的就是 AP 染色，sox-2  oct-4  nog ，SSEA4我再去查查，就打算做个免疫 组化定性鉴定下，请问是一般的组化流程对吧？; ~% @  S4 G% U$ b. l  _
复苏是1支/孔，冻存是六孔板融合到90%，孔/2支细胞，冻存是 0.5 ml 体系，求问复苏密度？我看这个细胞太稀和太密都特容易分化。  S( i1 {5 ]: i4 g$ r% p) Q
知道养出的是 H1 ，但是最近发现接种密度很是个难题，我现在是按 4*10^5 种六孔板 2 ml 体系，然后6天传代，1：6传到六孔板里。感觉应该5天理想，求问种瓶密度？/ j4 a6 ^9 G4 `3 q: o1 c
还有在现在的培养中，还未到传代就出现分化迹象，复苏时用mTeSR1+Y27632，每24H 传代$ T. L, R" F3 r2 h( K) ]
，传代只有mTeSR1。0 d/ L* t; r% {# y
希望得到老师的答案，如果有 protocol 可以分享，。不胜感谢

shaozi402

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! e3 C' F0 g( R& ]+ E, X
0 {5 m3 R2 S' ~& R1.一般的免疫荧光染色流程即可. d  E. [. J0 S
2.复苏密度通常是传代的2-3倍，太密和太稀均易容易分化8 V" K; o# ?% l# s  f
3.关于接种密度可能与细胞的状态和所用培养基有关，我们通常用mTeSR1，密度在4-5*105较合适，也是2ml体系。
7 w) T( M$ Z' [& Z1 D$ k5 O4.传代时前几次最好能够计数，把握以下哪个传代密度是最适合您的操作的
4 B- D( G. t3 z" @3 I: W6 z: Q5.还未到传代就分化可能是与细胞状态与接种密度有关系
/ {- \( _" a" q. f7 J4 X+ F6.复苏时用Y27632，传代时候也要用Y27632。传代时用与不用Y27632做过对比，不用Y27632时死细胞太多，细胞几乎不能活下去。
1 t, Q# X, `- {/ n, Q7.个人认为冻存时六孔板融合到90%有点密了，80%即可。! M% z/ n6 I, \) r9 [) F
8.目前没有正式的protocol，没有进行过详细的总结，回头有了详细版本再与您交流。

缥飘实验员

回复 shaozi402 的帖子, {+ [* a7 a; ]" v5 _$ w" C7 W

2 H2 n- F; M3 u# S: s谢谢您的耐心回复。2 V9 g; v2 Q) U( M) p( ?
现在实验室也有几个人在养，接种密度密度在4-5*105较合适，2ml体系
, C& f. h* g6 [) N0 b学到了复苏密度，这个很有用，很感谢，这边现在没有人做复苏的密度培养，差不多1*10^6传代即可，没有那个多细胞, D1 G# H. t% }1 p
培养时 加 Y 不加 Y 我这次传代试做一孔对比培养，现在实验室的都没有加，细胞有的时候好有的时候不好，不能控制
# T7 [) B2 H2 `2 ^/ `' S借鉴冻存密度80%，太密容易分化
' g6 M8 }9 b" f+ f! Z  g" u再次感谢，希望有机会以后能多跟您交流学习$ I- y5 }1 |( l1 [. `: G. |1 J

shaozi402

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4 v+ m! c0 r" p7 o. S3 `' V' ~8 B0 e3 c3 K2 e. ^) a
客气了，共同学习

缥飘实验员

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% r: V- [5 P+ w* s& o. L: E0 q求问sox-2  oct-4  nog ，SSEA4在干细胞中的表达位置，是否需要破膜处理，谢谢！

Emily2014

sox-2  oct-4  nog 表达在核要破膜， SSEA4很容易染的，我们做的时候这些标志物检测通用一个流程， 都破了膜滴 。 H1的鉴定应该包括，免疫荧光检测除了你提及的还有SSEA3、TRA-1-60， TRA-1-81阳性， SSEA1阴性， 及RT-PCR检测干性标记，  AP染色，核型鉴定， 端粒酶活性检测，EB分化实验加鉴定，再还有就畸胎瘤实验啦，

Emily2014

H1用有或者无饲养层体系养都很可以，而且适应于无饲养层体系培养，耐受消化传代，消化传代可以不用加Y的哦， 那太浪费了， 只有复苏时候加Y

缥飘实验员

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1 Z6 F, |3 a4 V! d- ?谢谢老师的宝贵意见