求问培养基里死细胞太多对培养体系的影响，因为h1全死掉了，告急，谢谢！

缥飘实验员

各位老师好，我养的h1细胞最近发现在第四天全死掉，因为每24H 换液，换液时我没有摇晃孔板尽量清楚死细胞，导致死细胞在培养体系堆积，最后导致整个孔板的细胞飘忽死亡，详细见图。我相知道的事，因为其他的孔板也是没有摇晃换液，只是单纯更换培养基，细胞长得好好的，但是这孔板细胞就出现了意外，原因应该是死细胞太多。我求问死细胞怎么影响这个培养体系从而导致细胞死亡，或者还有其他的原因，求问6 H! c' J: H3 o
现在养的 H1 容易分化，，求尽量避免分化的实验细节，谢谢！

ytumuyangren

死细胞对细胞的培养没有那么严重，没看到图片，个人认为可能是在换液的过程中那个孔里的细胞污染了，有没有看到你死掉细胞的那个孔培养液的颜色和别的孔不一样的地方？

缥飘实验员

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- t1 }; I4 Z' S4 `1 I5 w. R6 m图挂了，颜色和正常的一样，，没有污染，就是 H1养着分化头疼，谢谢提醒

yeshch

颜色一样不代表没污染，尤其是支原体污染前期不明显，越到后来死的越多；鉴于你其他孔板没问题，所以考虑很有可能是支原体污染，建议做一下检测。至于分化的问题，我有两个建议：不要等克隆长得太密，克隆相互接触就容易分化；第二，发现有分化的克隆在换液时及时用tip头吸除。等你好消息

shaozi402

前段时间我们实验室也出现了H1分化的情况，从学生到助理到实验员，所有人分别养H1，均有分化，后来让stem cell公司的人过来看，说有可能是培养基的问题，用的这个批号的培养基有问题。

缥飘实验员

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1 V. l$ ~' n6 f( s  l8 z
9 v7 E! T) V6 k. B. L& L那你们换了培养基问题解决没有，我们实验室现在就这个情况，从学生到助理到实验员，所有人分别养H1，均有分化，让stem cell公司的人过来看，也说有可能是培养基的问题，还在等待公司回信。

缥飘实验员

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' y5 J/ o9 R; I3 c, u# ^) }- D
老师好，求问您实验室问题是否已解决，换了培养基之后分化的情况怎么样，我们是加 Y 复苏与冻存，D1换液后培养不加 Y 体系，期望收到您的回复

shaozi402

回复 缥飘实验员 的帖子7 i! ]+ o2 y, C. [& J

! L5 n, H0 R( s现在还没有，主要是那一批培养基的批号已经找不到，不知道批号。还有一种说法是酶的问题，accutase消化后单细胞较多，而胚胎干细胞传代最好为克隆传代；现在实验员在用dispase酶试用看是否有效，dispase酶不能将细胞消化为单个细胞，dispase酶消化后，用刮子刮下细胞，此时细胞为小块状，此时再传代，可能会好一些。现在在试用这种酶，还没有结论

yuanyecat

如果你是刚引进的细胞,这样的话在最近的一星期细胞的状态可能会不好,这时候需要有耐心.需要注意:3 J+ \; P  Y) @2 ~
1.不要买回来的细胞系就马上进行实验,细胞是需要有一个稳定和舒适的生长环境的.因为外单位的培养体系与环境肯定与你的不同,这时候你需要等待细胞生长的,最好是能同时购买一些外单位的配制好的培养基,这样可以对细胞的恢复有利.如果实在没有的话那么就需要你在培养新细胞前的准备工作一定要充分.(准备工作园里很多资料)8 X' k2 a# M3 ^. v& z" |
2.购买的细胞在运输过程中肯定会有部分细胞死亡,这时候你所要做的不是继续"折磨"细胞将死细胞试图全分离出来,如果你能保持标准化无菌操作,这点死细胞其实并不会太影响总体.等待细胞活性恢复较好后传代几次就可以把死亡或凋亡的细胞淘走的.
8 ^9 f) m4 M  ~" n" F3.如果你买回来的细胞生长状态实在不好,比如你观察到每天都在减少和镜下状态越来越差,如出现空泡和细胞皱缩等等,可以尝试使用较高浓度胎牛血清(15%)刺激其生长.待状态恢复后继续使用标准培养基(10%).* Y$ t) J$ z( p
4.等细胞状态恢复较好时,最好立即冻存一部分备用.虽然是肿瘤细胞,长时间传代依然可能会造成其他变异细胞存在(如干系变为旁系,旁系转变为干系),影响实验.最好是定期做染色体或融合基因检测细胞是否变异.
- @+ H; w4 n$ e我想已经说的比较清楚了.有问题继续交流) _" {9 V1 \1 J( S4 E% T

缥飘实验员

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/ M0 H! F4 D; O: q& }
. A& K. d2 D2 L3 {2 q3 ^0 \) q$ W% g) w你的意见很用用，H1 人胚胎干细胞的体系还是稍微有不同与癌细胞，这个细胞在实验室意见养了很久了，只是最近的细胞老是出现分化，导致得不到 H1细胞，现在主要是这个问题，谢谢！希望以后多交流