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鸡精原干细胞的分离培养5 [, \: e; p. V2 l/ u& }8 e
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提前两天准备饲养层，明胶铺板（封口膜包裹）( T' E) U/ H# P9 D% \) @
+ {1 H2 _' r1 q! Q8 R' ?; ^6 F' z( d1. 取适当日龄的小鸡（一般为20-30天）用75%的酒精消毒。
9 D# z& d/ S J- H4 B2. 腹部朝上，用剪刀剪开腹部，拔开腹腔内容物，取出睾丸（有两个白色的睾丸者为雄性）。# A( }7 ]. f0 t' \
3. 放入另一盛有PBS的平皿中（PBS+双抗），浸洗三次。
: y% |# V) V% h! G _4 @4. 在体视显微镜下剥离睾丸白膜和血管。
" }# s0 c2 F$ i% [2 ~5. 将剥离好的睾丸移入培养皿中吹打洗数次，留少量液体，剪碎。
( Z8 y0 Q- V5 ]4 N1 L6. 低速离心洗2次，沉淀后弃上清。
0 _, p2 v/ u5 U. w, B: i* x7. 用胶原酶（最终用量为10倍组织块体积）消化（培养箱中30分钟，摇晃３次）。（胶原酶使用前用无血清DMEM 10倍稀释。）
; e; m' x1 C$ p1 ~/ s8. 1000 r/min 离心３分钟，弃上清，组织块用10倍体积胰蛋白酶消化5分钟，吸管不停吹打。添加少量PBS ８00 r/min 离心１分钟，收集上清300目网筛过滤（培养皿）。加含血清培养基终止消化。! s% N: N/ X+ A. m. @0 _
9. 剩余组织块再用胰蛋白酶消化一次。300目网筛过滤。加含血清培养基终止消化。5 ] }5 u; V1 K o0 a$ |1 m
10. 1000 r/min 离心5分钟收集细胞。（计数，涂片观察、检测活率，AKP染色等，调整细胞浓度至3.5~４ⅹ105/mL混合培养。）) B! Q/ W9 w. i; \/ ]+ u
11. 用11%、19%、27%、35%、43%梯度的Percoll离心（离心管，2000 r/min,20-25分钟）。（10毫升离心管，不同浓度分离液，从下至上为43%，35%等，细胞浓缩悬液）8 p, Q6 n7 ]# \6 P
12. 收集27%~35%梯度的细胞，用培养液(DMEM培养基，添加10%小牛血清)洗涤两次（1000转，5分钟）进行评估。用含因子DMEM重新悬浮细胞，调整细胞密度为1ⅹ105 /ml，接种在6孔培养板饲养层上。% F- V8 E; t: R& P4 z% y
13．24h后换液以除去死细胞。此后，每24h观察，每48h三分之二换液。4 H0 a! i0 e+ c) J! v
14．SSCs培养5～6d时，饲养层细胞开始老化。此时需进行传代培养，用胰蛋白酶消化液把SSCs克隆和饲养层细胞一起消化下来吹打制成单个细胞悬液，重新接种到新制备的饲养层中培养。先用PBS清洗去除死细胞，再加10滴左右0.25%胰蛋白酶消化液，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度即停止消化，加入适量培养液将细胞吹打下来，采用多次消化以离散SSCs集落以减少对SSCs的损伤。将细胞悬液移入经0.1%明胶处理过的培养瓶中，在38℃，5% CO2 的培养箱中孵育1～2 h后，消化下来的成纤维细胞大部分已经贴壁，而SSCs和少部分成纤维细胞仍以游离状态悬浮在培养液中；此时，吸取上层细胞悬液移入新的饲养层上继续培养。/ m3 l) M f; Q/ h1 E* t0 [) |) l
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鸡原始生殖细胞的分离培养& r: T" N9 W$ e5 ]
基质细胞混合培养：" v) f( U" Q$ o( X
在解剖镜下用玻璃针挑取生殖腺，将取下的生殖腺发生部位用PBS浸洗三次, 5～10 ml Trypsin+EDTA消化液室温下消化5min , 消化时辅以硅化的玻璃吸管轻轻吹打使分散，终止消化，300目网筛过滤。1 000 r/ min 离心8 min , 弃上清, 用含细胞因子的培养液重悬沉淀，调整细胞浓度至5ⅹ105/mL(细胞密度约5枚生殖腺／mL)，机械吹打5min后，接种于4孔培养板中，每孔加４00μL细胞液（酶解法，与基质细胞共培养，不经Ficoll 密度梯度法分离）。置38 ℃、5 %CO2 培养。24 h 换液, 以后每48 h 换液一次。于培养箱中连续培养。集落在7天左右出现，之后当其周围开始出现少许分化迹象即应传代。 |
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发表于 2009-3-19 22:02
