诱导骨髓间充质干细胞成骨方向分化

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成骨诱导培养: 取第 3代细胞, 接种入含体积分数为 * ]* z$ _: t0 c
0.1 的新生牛血清 、) C" l6 I4 R, y; l4 }
0.1  μmol/L 地 塞 米 松 、9 m3 V8 z5 s& u
50  μmol/L 抗 坏 血酸 、1 T% |' ]& I6 _1 w. g3 }7 Z
10 mmol/L β- 甘 油 磷 酸 钠
* x; ~7 F$ x, K  f的 高 糖 DMEM培养基进行成骨诱导培养, 进行形态观察、功能检测。间充质干细胞成骨特性检测:   
, R. L" E8 T0 V! P1 d①碱性磷酸酶组织化学染色:
: y  t# R, I' g2 o取成骨诱导 14  d 的细 胞 , 40  g/L 中 性 甲 醛 固 定 15  min, Gomori改良钙钴法染色。取 5 块玻片, 每片随机取 2个视野, 采用网格计数法, 计算碱性磷酸酶染色 阳性细胞的百分比。
  Z7 E' Y2 H2 r1 c; o6 O& Y②碱性磷酸酶活性检测:
7 W4 E! Y' F; G# B7 J2 d取第 3 代细胞, 以 1×105/ 孔的密度接种于6 孔板中, 分别成骨诱导 3, 5, 7, 10, 12, 14 d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。
- X- I- T1 g7 V" c; H4 Z! Y③钙结节染色: 3 `6 A! t4 }( p# S8 A; a
Von Kossa’s矿化结节染色法
% n  \! i! T: D# _* F9 ?3 B原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。$ `1 ]8 X% ?9 C7 K$ ?
Van kossa银染色法
. j  q' S8 i6 x7 Q试剂：
' q9 ~; O8 {# i) y/ f  1．2%硝酸银水溶液：硝酸银2g蒸馏水加至100 ml。
8 f1 B  \$ v! J3 w) L+ C  2．5%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠5g，蒸馏水加至100 ml。
7 U# l; Z5 g' d. h2 s9 `  s
9 p- ?# u3 c! W) _9 }培养皿用PBS冲2次，95%乙醇固定10分钟，蒸馏水冲洗3次
, f+ p: b* R3 D! j) G6 k2. 2%硝酸银内置暗处1小时
' j7 q! C4 h' K3. 蒸馏水冲洗3次，再流水冲洗10分钟
6 E$ K/ E/ S! L. T. }+ c4. 还原1小时（硫代硫酸钠5g，氢氧化钠0.2ml，蒸馏水100ml）# ]/ Q* Y5 E: L$ S
5. 5%硫代硫酸钠1小时# g1 g( a0 B& }5 g  t
( |  g( o) q, v* M& V% _
1.固定后的细胞爬片用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤2遍；' ?0 {; i: ]7 Q1 J4 \- ^2 w
  2.浸入5%（也有1％）硝酸银水溶液中10min，日光或紫外光曝晒10－45 min，蒸馏水洗涤；
( [) r- ^# c0 C7 ]    3.浸入5%次亚硫酸钠（3%硫代硫酸钠冲洗）溶液中，蒸馏水洗；# B  \0 ?. U8 K. t9 L3 V. u1 m
    4.1%中性红衬染1 min，水洗，晾干，酒精系列脱水（常规顺序：80％－90％－95％－100％1－100％2），二甲苯透明，中性树胶封片。) u$ w" A+ v+ `) H' Y/ O
        1. Sections to water. 切片脱蜡至水  
9 {" o4 e9 ^% v& P) @2. Place sections in 1% silver nitrate solution under ultra- violet light for 45 minutes. 9 D( K) E4 h1 M6 r
置于1％硝酸银溶液在紫外光下45分钟
. U6 R+ t5 j: U" _. ^3. Wash in distilled water. 蒸馏水漂洗  y8 s, d3 Z+ k4 ]. R
4. Treat with 3% sodium thiosulphate for 5 minutes. 3％硫代硫酸钠处理5分钟
' R4 p- }7 ~, j5. Wash in water. 用水漂洗
4 z( v' T. e0 I6 O# d7 M6. Counterstain with van Gieson for 5 minutes. Van Gieson复染5分钟
% u" L3 @0 E8 Y2 J7. Wash in alcohol. 乙醇漂洗
. I0 |1 x  _: Q) I+ \& w! i8. Clear . Mount sections in DPX 透明封片/ w3 x/ e0 O# l
  结果：钙盐沉积区域呈黑色，背景红色.* u2 T2 {: v% A' b. ]+ G5 k; }

0 w# g+ w! g0 ^6 \) qA 组以现行报道方法染色:4 %多聚甲醛固定标本 ,
$ C5 J3 {* j% \; |. [  M* R1 %硝酸银溶液紫外线下染色 10min ,
% Z) ?8 }# R$ p+ v' k用 5 %硫代硫酸钠染色 2min ," a$ r9 _1 q: L" Z! Q9 G3 t+ [' P
1 %中性红复染 10min ,
* B0 c2 R) [( A' Z% o' C酒精冲洗后观察。, q5 C  y& |+ v7 M( B  W
+ l# d2 s0 Z' ?6 |
B 组以改进的方法染色:% f7 ~1 B8 r2 k" f" g; I4 E7 d: D
4 %多聚甲醛固定标本 ,' ]5 Q( b: r7 w/ V4 a: ?! b, d
5 %硫代硫酸钠孵育 30min ,蒸馏水冲洗
. i$ s; Z$ a/ M4 S/ @,然后用1 %硝酸银溶液紫外线下染色 30min ,
/ I; D/ j# U: V& Q; z# D蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质 ,
( S% e& m" P2 P继续用 5 %硫代硫酸钠染色 2min ,/ V  x3 c4 \0 n, X) q, u, c
1 %中性红复染 10min ,蒸馏水漂洗后观察。
' v" Q1 N6 c" h: V4 p! y! R
' s- i; x- x9 X) K或取成骨诱导 21 d 的细胞, 体积分数为 0.95 的乙醇固定 15 min,
4 `. ?6 M+ J& s% k- S10 g/L 茜素红 S 染液在室温下浸染 10 min, 3 @& b1 ~8 q& {! ]
去离子水洗涤3次,
0 K% ?2 h& w% k; [6 y" T( S/ E% D倒置显微镜下观察。( P* [4 o9 [. I/ V- D
二、茜素红染色# V) c, y+ X6 E; \; g) ^3 ?2 d
茜素红S
9 e( G# _7 H/ D( v3 I' \+ A中文名称: 茜素红S英文名称:alizarin red S; sodium alizarin sulfonate+ Y# i) x' z. F: I" h% x
CAS: 130-22-3分子式: C14H7NaO7•H2O分子量: 360.28中文别名: 9,10-二氢-3,4-二羟基-9,10-二氧代-2-蒽磺酸单钠盐； 茜素红；（3） 茜素磺酸钠 ；茜素S ；酸性媒介茜素红；酸性媒介红S-80（Acid Mordnat Reds-80）；C. I.媒介红3（C. I. Mordant Red 3）。
/ ?' l1 _0 {$ X, r& @性质：橙黄色的针状体。溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿和苯。1%水溶液pH2.15。由茜素经发烟硫酸磺化，然后转变为钠盐制得。茜素红能和许多金属离子生成稳定的红色络色物，在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；酸碱指示剂，第一变色范围PH值3.7(黄)～5.2(紫)，第二变色范围PH值10.1(紫)～12.0(浅黄)；用于极谱法测定金属离子。
8 |2 G. _  i% l* N/ C9 a用途: 络合滴定指示剂和酸碱指示剂。1 `. W: `) Y- q  T/ z6 D' k
配制：将托盘天平上称取0.1g茜素磺酸钠定溶于100ml蒸馏水中转移入滴瓶中，贴标签备用。 或用茜素红粉加PBS溶解后，要注意调节PH值到7.2！过滤就可以了。0.1%的茜素红Tris-HCL(PH8.3), Tris的浓度做分子生物学一样的，用0.1mol／L的HCI或0.1％的NaOH调节。- J2 M% d9 i6 N2 H3 U6 ]
茜素红染液配方9 \# ]* W* U4 Y6 c5 {
配方一 茜素红染液（Ⅰ）
8 P+ c: X7 Q' B, W取冰醋酸5毫升、甘油5毫升、1%水合氯醛60毫升混合。在这种混合液中方入少量茜素红，制成茜素红饱和溶液。% e  G5 V: G* g4 ]" k  D
配方二 茜素红溶液（Ⅱ）
4 R8 [6 z" u) e( J8 o取1克茜素红，溶于100毫升95%酒精中，搅拌，然后跟900毫升1%氢氧化钾溶液相混，即成深紫色的茜素红染液  H6 ~0 A" _' q! ]" U
?茜素红(Fluka)溶于96％乙醇中配成0.12％的茜素红液。
  C5 u! F$ H6 [5 z1 L配方三& U8 W( K; X# C: m
0.1%的茜素红配Tris-HCL(PH8.0) 9 S6 m6 z7 X; J" j1 s( m6 P
具体配制方法――1g Tris（1g左右Tris均可）加入三蒸水100ml中，用滴管往配制液中加HCl（分析醇），一滴滴地加，边加边测试PH，待PH为8.3左右即可（无精密PH测试仪，用PH试纸也是一样的，但是要能测到8点几的PH试纸），配好后往里面加0.1g的茜素红，便得到0.1%茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)溶液。9 h: N. z  K/ S+ C0 c
茜素红染色步骤
+ p) i- |. \: I6 {& ?/ j) ?1、弃培养基，培养皿用PBS冲洗2次，- D9 X! ]8 N! V. ~3 E" ]
2、95% (也有90％)乙醇固定10－30min，蒸馏水冲洗3次% e/ T/ Y, T4 F! \! R! n
3、 0.2% （or 0.1%）茜素红[茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)]染色,37℃,30min ,用清水冲洗。1 T: P7 l3 c0 I7 ]" ~& C; C
在低倍镜视野(4 ×10) 下进行矿化结节计数0 J) J5 ~% ?) t  I, R+ R4 |, [2 l
# A. R5 A5 Z5 H. \/ q' Y8 L
钙染色法—茜素红法 3 e# O- X6 |& U# f
染色步骤 9 n# J/ B' m5 x
1． 茜素红S染液5分钟 1 q! q& Y; f( U$ w
2． 用丙酮洗20分钟
7 c6 B1 n; R0 {8 O7 V; ]4 y% L* {3． 丙酮：二甲苯（1：1）溶液20秒
6 t6 c7 }7 d3 @. x6 _. N' n$ v4 Q4. 树胶封固
" f7 F% w1 J/ q/ a" `' |" h+ K结果：钙累及物呈桔红色6 D  _2 t$ I* j2 y" D
8 C& L6 i. D' v; \' Z# ^4 Y" d
④Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色（成骨特有）
. Y4 c4 @) s+ @$ M% s% q' }取成骨诱导 7  d 的细胞爬片,磷酸盐缓冲液漂洗, 4 ℃ 丙酮固定 10 min, 磷酸 盐 缓 冲 液 洗 3 次 , 5  min/ 次 ;   体 积 分 数 为0.03 的过氧化氢孵育 10  min, 磷酸 盐 缓 冲 液洗 3 次, 5 min/ 次;   血清封闭液封闭 15 min, 倾去封闭液, 磷酸盐缓冲液稀释的Ⅰ型胶原Ⅰ抗 4 ℃ 过夜, 磷酸盐缓冲液洗 3 次, 5 min/ 次;兔抗羊Ⅱ抗室温 1 h,   磷酸盐缓冲液洗 3 次,5 min/ 次; 辣根酶标记的链霉素卵白素工作液室温 15 min, 磷酸盐缓冲液洗 3 次, 5 min/ 次,二氨基联苯胺显色, 自来水冲洗、复染、脱水、透明、封固。