干细胞表面抗原标记检测用直标法还用做阴性对照吗？

dragon513

有资料表明，直标法因可排除标记的多克隆二抗的非特异性结合而比间标法特异性强，请问我采用直标法检测干细胞表面抗原标记检测还用标记的同型对照（IgG1或IgG2）做阴性对照吗？怎么做结果更有说服力？
6 O$ v' m6 z' v    谢谢！

czzhaozhu

谢谢！很有用！

骨道边

谢谢分享
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dragon513

谢谢大家关注，近来已请教过不少这方面专家，基本意见是从严格意义上讲应该做，但大家一般都没做。所以如果要求不高就不用做了。

xuyuhappyfish

我认为同型和空白对照任选其一，而同性对照肯定好于空白对照。正常对照是必须的，而阴性对照和阳性对照就看实际情况选用了，如果老是不能染色，可以使用阳性对照

猪笑天

很好

waji_42

谢谢

wangabu

好贴，顶一下，谢了

koppera

谢谢

dragon513

关于流式分析时的对照设置找到参考答案了，与大家分享交流，仅供参考！) ^) B5 M) S9 ?6 \( h! F
    流式细胞术分析免疫表型必须设置各种对照(ｃｏｎｔｒｏｌｓ),包括阳性对照(ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｎｔｒｏｌ)、阴性对照(ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ)、正常对照(ｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌ)、同型对照(ｉｓｏｔｙｐｅｃｏｎｔｒｏｌ)、空白对照(ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ)等。对照的目的是避免各种因素可能造成的假阳性或假阴性反应。1 阳性对照:是检查已知阳性标本能否用所测条件与方法确定为阳性,如ＣＤ3的ＭｏＡｂ检测正常人血液Ｔ淋巴细胞的阳性率一般应大于60%以上,若明显低于此值,则有可能是ＭｏＡｂ的质量与浓度、荧光染色条件、流式细胞仪的状况等存在问题。阳性对照达不到要求时不能进行临床试验。2 同型对照:是指与ＭｏＡｂ相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类,若使用直接免疫荧光染色法,同型对照也应标记荧光色素,如ＩｇＧ1 ＦＩＴＣ、ＩｇＧ2ａ ＰＥ等。主要考虑了细胞的自发荧光、ＦＣ受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外,同型对照与ＭｏＡｂ所标记的荧光色素、浓度、Ｆ:Ｐ比值(标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值)应该相同为最佳,这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义,切忌使用与ＭｏＡｂ不相匹配的同型对照,最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备(如同一品牌)的产品。3 空白对照:仅以缓冲溶液,如ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ缓冲液等替代ＭｏＡｂ进行试验,其余条件与阳性或同型对照相同。空白对照主要用于观察细胞和缓冲液中所含物质的自发荧光。由于一般标本细胞的自发荧光极弱,又已做同型对照,免疫表型分析时可以免做空白对照。4 正常对照:用健康人、近期无感染、未使用任何药物的标本(如血液)作为对照。对一种新的ＭｏＡｂ(如ＣＤ19 ＦＩＴＣ),在使用前进行对照试验,可了解其性质、效价等特性是否符合实验要求。在临床试验时,为了避免一些不定因素可能造成对实验结果的的影响,以及与患者测定结果比较,常常需要正常对照。例如,正常对照血小板ＣＤ41阳性百分比应至少>95%以上,平均荧光强度(ＭＦＩ)比同型对照强5～10倍以上,若正常对照出现异常结果,则不能出实验报告。5 阴性对照:是指用已知不表达某种抗原的细胞作为样本检测,应出现阴性结果的对照试验。阴性对照试验可以避免ＭｏＡｂ的纯度不够或特异性差等因素造成的假阳性结果。如血小板无力症(Ｉ型)患者,由于其血小板缺乏ＣＤ41和ＣＤ61,可作为最好的阴性对照。测定血小板膜ＣＤ41时,方法同正常对照,只是将正常人血液替换为血小板无力症患者,血小板无力症Ｉ型患者血小板膜ＣＤ41阳性血小板百分比一般<5%。6 自身对照:待测标本为混合细胞(如血液或骨髓)时,若检测其中一种细胞的免疫表型,则其他细胞可作为对照。例如,测定外周血中白血病细胞的髓过氧化物酶(ＭＰＯ),白血病细胞为阴性,成熟中性粒细胞应呈阳性(阳性对照),成熟淋巴细胞为阴性(阴性对照),可以准确地判断白血病细胞ＭＰＯ为阴性。此种自身对照可能比外加阴性对照或阳性对照更可靠,尤其是在细胞内抗原分析时更是如此。