qRT-PCR 引物设计请教

芦苇浅

最近设计了一批qPCR引物进行测试，我每个基因都设计了2-3对引物，测试时一组不加模板检测引物二聚体的形成，另一组是正常加同一种模板的实验组。根据测试结果，本人有以下问题请教大神们：9 w- C( v/ j" w2 S
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1. 对于2-3对针对同一个基因的引物而言，为什么有一些得到的ct值会相差很多，如果都是针对同一个基因，使用同一个模板的话不应该得到的ct值相差无几吗？0 ^) W3 E- j# c
2. 针对1的问题，那么我应该选择哪一对引物呢，此时的取舍是否会造成将来定量实验的误差呢？
- f! h, h+ _9 Y4 P% D3. 通过溶解曲线观察，添加模板的样品在80-85度有单峰，而引物没有形成任何峰，ct值在30左右，是否能够说明这对引物非常特异呢？会不会有一种情况是扩增出来的目的产物根本不是我想要的产物呢？（PS: 大部分引物我都用NCBI primer-BLAST做过比对，基本没有其他比对产物）
' |6 P3 I1 R/ K; a' E! \- L谢谢各位的解答！

芦苇浅

求答复啊

蔚海橙天

针对一个基因设计的不同引物，出现不同的表现是很正常的：& A7 I; W5 l: z. H4 Q% z
可能的原因有：" `/ @3 f. R' I  i9 Y
1. 选取的具体序列不同，GC含量不同；2.引物形成Hairpin；3. 形成Dimer，等等。
; L2 W4 x4 a+ j) l' O2 R- c/ \; S0 F而且即便用BLAST进行比对，但在实际实验时，仍然可能出现问题。% Z, t) O$ k2 l8 J
建议设计好的引物不要直接来做QPCR，除非你很有钱，可以先做普通PCR、跑个胶检测一下引物，看看是否条带单一，是否形成二聚体等。
+ {6 j% f, U4 v, Y9 j( B" |; A; w6 V* _1 |( H. Q2 X
此外，虽然这类实验已经很经典，但是还建议多看些引物设计的书或帖子，哪怕是你所使用仪器或试剂的说明书，多研究一下，上面也会有很多提示的，因为具体到每一个实验都可能会遇到不同的问题。
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# k4 Y* E6 v  W' ^祝好