Western 问题求助

顺其自然

求各位WB大神帮忙 我是一个WB新手，最近做了几次WB，每次条带都出现下面的情况（如图），即，每个泳道跑出来的条带的宽度都不一样，求各位帮忙分析和提出宝贵建议。衷心感谢啊！

savid888

想到几个原因供你分析：
4 b6 e& H1 h6 G( w# A) j/ \1. 胶凝好了没？' E  u: L7 u% X3 w; I. S
2. 拔梳子的时候孔有没有变形？& I2 @. P7 w0 J: ]+ g& ]
3. 样品上样前有没有离心？1 L+ e; u) v% e% F' a( C0 R3 c
4. 在膜上孵育抗体是否均匀？' s1 z+ T# l- n

luckyliu

楼主这个问题，以前也经常遇到，( M" a( J0 U5 g, ]
1，最大的可能是胶没配好，配的时候尽量混匀，等下层胶彻底干了以后再加上层胶；8 E! X7 R# q, A2 j
2，转膜的问题，/ i9 ~; M& w- X0 ?# h
3，样本本身表达就有差异，可以减少加样量；9 T  ]0 S" Z. ^( D3 C
4，最好隔一个空白孔加一个样

cyz3057

请问你做的是内参吗？

顺其自然

回复 savid888 的帖子8 V8 \( ]1 o, C, V) v$ `

0 A0 G+ Z: J+ {' s3 Z1. 胶凝固好了的；
- B- Y6 w7 p7 ]  r5 b& {" i3 f; p: O2. 拔梳子的时候孔都还好，每次都注意看了的，感觉没有啊，呵呵~；
6 \1 l; o, R! \1 P# Q5 T3. 样品上样前需要离心吗？这个条带的宽度不均一与样品离心有关系？？？；
# A0 Y# i) U! k. E4. 膜孵抗体时，整个膜都均匀的浸泡在抗体溶液中的，所以，应该不存在这个问题。
8 [" X! w  C. W6 F0 u: [$ C
8 r6 V' `; q6 @& R不过还是非常感谢你的帮忙哦，谢谢啊！欢迎继续参与讨论，谢谢~

suning5

这东东，就是要多做几次，才能出一次好的数据

顺其自然

回复 cyz3057 的帖子
# y* z0 m& h' m# g4 B9 w: n, }# S/ j1 r: L. i0 v* B9 O) u
嗯嗯，是的啊，呵呵~

顺其自然

回复 luckyliu 的帖子) H) y. Q! p+ H/ M. v
( G* \  T4 G5 g5 y/ r
1. 可是胶配的感觉没问题啊，呵呵呵~' O  ~. l3 w2 v3 X' [, s6 o% {5 \
2. 转膜的问题？ 请问转膜可能有哪些问题会导致这种情况呢？4 n4 e7 X: t4 J" L
3. 样品本身表达的差异只会导致条带的明暗，宽度不影响吧？我的问题关键是各个泳道的条带宽度不一致啊。
& _8 i2 e" o/ @' i4 w1 x0 W4. 这个建议下次我试试，呵呵呵~2 @, G# G% o) m8 y! u
非常感谢你的回复，谢谢！也欢迎继续讨论哈，呵呵呵~

wenyangapple

楼上几位说的都没错~
0 c* a  y% l% ~4 V我再加一条吧：窄孔和旁边的孔他们之间离子强度不一致。可能是蛋白样品含有的buffer成分不一样，或者上样的时候loading buffer的量不一致。

顺其自然

回复 wenyangapple 的帖子
" V, \* Y" _+ I3 S! x
' F: P! S6 _5 d6 ^" Q2 ?9 W还有这种可能？可能与每组样品的loading Buffer的量的不一致有关？
' _- B& n" g! P5 {非常感谢啊！