细说循环肿瘤细胞的前世今生

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近几年循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现逐渐崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段。4 M; q, W! B4 v" K
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循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞, 是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。近几年CTCs在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现逐渐崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，临床应用价值极其显著。与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比，优势显著，可更加敏感地发现疾病的变化，更加科学、迅速的评价某一治疗方案的效果。而且分离富集CTCs只需抽取患者少量外周血，对患者没有副作用，因此可以高频度的监测，达到实时监测疾病进展的目的。更为重要的是，CTCs可作为分析患者肿瘤生物学特征的实时样本，可以发现患者的实时生物学变化，并根据结果及时调整治疗方案，实现实时的个体化治疗。
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- v9 `& C- d7 r9 P3 u8 {早在1889年，Paget提出了 “种子和土壤”的学说，强调癌细胞和微环境之间的关系，认为肿瘤转移的形成，是处于旺盛生长状态的肿瘤细胞作为“种子”，当遇到合适的器官、组织的基质环境，即“土壤”时，就会发生肿瘤的转移。在1896年，澳大利亚学者Ashworth在一例转移性肿瘤患者血液中首次观察到从实体肿瘤中脱离并进入血液循环的肿瘤细胞，并率先提出了CTCs的概念。不过长时间以来CTCs的检测并未在肿瘤病人的防治中发挥应有的作用,主要原因就是检测技术未取得突破性进展。从上世纪末以来CTCs检测技术得到了不断的改进，随之带来的是CTCs检测在临床的应用。FDA于2004年批准了Cellsearch系统在转移性结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌治疗中的应用，随着CTCs研究的不断深入，越来越多的肿瘤治疗会得益于CTCs的检测。/ ^" m- m3 z& H8 `7 J% q6 ?

! A  `( ]9 P! b, L7 k* D5 I+ A随着CTCs的临床应用价值凸显，近几年，国内外许多研究机构和厂家都在推出不同的CTCs检测技术。
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总结起来，CTC技术主要分为以下几种：
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以CTCs表面抗原和免疫荧光为基础的方法! `) t+ F# `6 J2 l7 Y: q9 ^8 y

7 {0 M# P* @: k$ u6 H  z市场上已有多种应用这种原理的检测设备，如CellSearch系统、CTC-Chip、免疫磁性细胞分选仪(MACS)、RARE Cell、AdnaTest癌细胞检测系统等。以CellSearch系统为例，CellSearch系统是目前惟一被FDA批准进入临床，用于预测转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的CTCs检测技术，这种技术集合了免疫磁珠分选技术和免疫细胞化学法的分离检测技术。其主要原理是利用偶联了EpCAM（上皮细胞粘附因子）抗体的磁颗粒与肿瘤细胞表面的抗原相结合，然后结合荧光染料的抗-CD45和抗细胞角蛋白(CK8/18/19)，最后采用DAPI染色来鉴定细胞核，EpCAM（+）CK（+）DAPI（+）CD45（-）的细胞被界定为CTC并进行计数。然而事实上，各种不同组织来源的肿瘤细胞只有70％表达EpCAM，一些肿瘤细胞由于发生了上皮间质转化（EMT) ，上皮细胞特异性抗原丢失使得单一抗体捕获CTCs的效率降低。' d5 J& \- L/ r+ S9 k5 ~' @

+ ~. C( @( I9 p) B2.以细胞大小差异和过滤为基础的方法（ISET）6 T# x, d) Y- t) U5 ^' W9 P
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这种方法是基于CTCs与大部分血细胞存在明显的尺寸差别以及CTCs较正常血细胞不容易变形。研究表明运用8微米的虑孔分离CTCs效果最佳。富集到的CTCs可再通过光学染色或免疫染色(免疫荧光或免疫细胞化学)从形态学特征或分子特征等方面来确认肿瘤细胞。ISET优势在于不依赖CTCs的表面抗原，不破坏CTCs的形态，保持了CTCs的活性，有利于利于后续对单个CTC进行形态学、免疫细胞学及遗传学特征的研究，而且这种方法的整个过程易于操作和控制，只是这种方法可能会漏检某些直径较小的CTCs。) v( @/ g% w5 \+ p3 f
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3.以DNA/RNA为基础的检测方法- E/ H* v% d$ V7 F

1 ?0 a1 D7 |1 q' {CTCs的某些基因或表达的mRNA不存在于正常的血细胞中，可通过对这些DNA或RNA的检测来判断CTCs的存在。这种RT-PCR的方法非常灵敏，可分析极微量RNA，然而因为该技术是以信号放大为基础的，稍有污染就容易造成假阳性的结果出现，目前，其在临床应用中最大的限制就是，缺乏特别明确的特异性标志物，发现明确的肿瘤细胞特异性mRNA对于促进CTCs检测的特异性及准确性至关重要。1 C0 i0 R% G$ g# j4 F! ^) h
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技术        描述        优点        缺点9 _) N: L! L- I
方法
# q$ o% ^  b6 m" n1 W6 ?Oncoquick        基于细胞密度对CTCs进行分离        保存细胞活性，有利于进行细胞病理、免疫标记及分子研究        灵敏性低，不稳定，可能遗漏稀有CTCs
5 P! l* [9 M: H' m: ~0 Y$ Q/ UISET        依据细胞大小使用孔径约8微米滤膜分离CTCs        一步离心，分离计数等可操作性强，保存活性便于后续分析        直径较小的CTCs可能会漏检
$ D# b1 F! V5 M& T* Z$ mMACS        通过免疫磁珠标记进行上皮性CTCs的分离        基于特异性标记物的分离，保存活性便于后续分析        正常细胞表达相同标志物可致假阳性，由于表型异质性可致假阴性. T# Q6 s3 J2 B3 E6 X5 A! z: k
Cell Search        使用EpCAM抗体包被的        半自动、高灵敏与可重复性，CTCs标记、鉴定计数有明确标准，FDA唯一认可        正常细胞表达相同标志物可致假阳性，由于表型异质性可致假阴性，难以进一步分析
- T: q+ ~7 N. S' {0 n9 Z铁磁珠进行免疫分离(CK19,CD45和DAPI标记进行检测）
0 x+ N+ w2 N5 I: ]9 r& R" C) VRT-PCR        基于肿瘤特异性基因的表达分析        高灵敏性        同上可出现假阴性和假阳性，难以进行形态观察, u) A6 |1 P+ e- V3 s
AdnaTest        通过特定抗原表达和肿瘤相关标志物分离，提取RNA进行RT-PCR分析        高灵敏性与特异性，有助于区分CTCs的干细胞属性与表型变化        非肿瘤细胞表达相关分子可致假阳性，表型异质性可致假阴性- r* E, Z" P6 _4 b- v
CTC-chip        使用含包被EpCAM抗体微柱阵列的芯片        高灵敏和高检出率，便于计数及分子表型分析        迄今报道资料有限，缺少临床验证7 a9 F2 _: j4 S  b. f. S& |+ c! h) Q
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常见CTCs分离与检测技术
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目前, 尽管CTCs检测分离的技术很多, 但是不同实验室之间没有统一的标准和依据, 同时不同检测方法敏感性和特异性不同, 这在一定程度上限制了循环肿瘤细胞应用于临床，但是已经完成及正在进行的大量研究已经显示出CTCs在临床上具有很大的应用价值。
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2 \& M8 T; \) s3 z2 e. F# n; ?目前， CTCs在临床上的应用主要包括以下几个方面：* h5 h: l* O! y

) Y3 t5 D* @: o" z; x1临床诊断和分期& {( _  E* O, A7 M9 }0 j
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研究发现在部分早期的肿瘤患者中，利用影像学还未发现病灶时已经可以在外周血中检测到CTCs，因此CTCs可以用于肿瘤的早期诊断，2007年ASCO就将CTCs纳入了肿瘤标志物。血液系统是肿瘤转移的重要途径，是否发生远处转移是判断临床分期的标准之一。近年来，CTCs检测在临床上的应用使之成为了TNM传统分期系统的有效补充，从而指导下一步的治疗。, X2 R6 ^% O5 v7 a  y( }5 u

4 s9 C' n* P; a1 `( C! g0 G2预后评估
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2 I) o2 A0 v; H- q9 w目前研究已经证实血液中检测到CTCs可以作为乳腺癌、前列腺癌和结肠癌等肿瘤的独立预后因素。CTCs监测数目越高，提示患者预后较差。在转移性乳腺癌患者接受系统治疗之前, 每7.5 ml血液中CTC计数超过5 个, 提示更短的无进展生存时间和总生存时间。在转移性结肠癌患者中，每7.5 ml血液中CTC计数超过3个，患者中位总存活期和无进展存活期都明显缩短。与传统的影像学方法相比，CTC计数能更早的反映患者的疾病状态及判断疾病预后，更能准确的预测患者的总体生存时间。
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; {- _! B# B+ \: d# Q; J1 P3治疗疗效检测
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目前肿瘤治疗的方式越来越多，如何评估患者的治疗效果显得尤为重要，研究表明患者在治疗前后CTC的数量的变化与标准的疗效评价体系有很好的对应关系。在肿瘤治疗过程中，通过动态监测CTCs数目变化，能够更加准确评估肿瘤治疗的效果。) e3 v: g2 ]$ r) m8 e
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4个体化治疗
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CTCs作为“液体活检”弥补了临床上获取患者肿瘤组织的不足，临床专家可以通过外周血富集分离CTCs，甚至可以在体外进行CTCs的培养，分析CTCs的分子表观遗传学特征，进行CTCs一系列的基因检测，筛选出适合患者的化疗和靶向药物，以期进一步指导个体化治疗。5 I- \4 x. e, X; [3 }

9 |4 e+ A1 B" w# @此外，CTCs也有助于研究人员更加清楚地理解肿瘤发展、复发、转移的分子机制以及及肿瘤干细胞在EMT、肿瘤转移、耐药性方面所起的作用，对于指导抗肿瘤药物的研发也有很大的意义。
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( C- A6 s% ^( |6 T尽管目前在CTCs研究方面已经取得了很大的进展，但是多种检测与分离方法在临床上的顺利实施仍然是今后待解决的问题，每种检测技术的结果并不一致，这就要求尽快制定行业的标准。同时可以结合体外动态检测系统、体内血液中残留基因分型的循环肿瘤DNA来加强CTCs的检测及对肿瘤进展的连续检测。相信在不久的将来CTCs一定会成为肿瘤治疗中一项常用的检测指标来指导患者实施个体化治疗。