有关癌细胞富集CSCs的实验几个问题

hangze037

回复 zz091115 的帖子2 a1 G  f& L# ]* Z. \& [
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您好，我最近也想做一些有关癌细胞富集CSCs的实验，但是从来没做过，周围也没见有人做过，所以很多东西不懂，想请教下您几个问题:+ @$ o* n$ A/ O* p
1.接板：细胞接板前需要用pbs重悬以下，洗干净原来培养基里面的FBS吗？细胞接板后，要不要间隔去晃一晃，有人说细胞在超低吸附板上也会有贴壁，需要不间断的晃一晃，请问有必要吗？
7 ?& h  R5 I; [' s! X" G" T* k' X8 H2.换液：细胞在培养的过程中怎么换液，离心速度与时间分别是多少，会不会把死细胞也一起离心下来了？需要全部培养基都换掉吗还是换一半？离心完之后重悬需要吹打充分吗？会不会把形成的肿瘤球吹打散了？
  h8 e8 S% x+ }. R6 X3.传代：细胞球形成之后，到什么程度需要传代？传代的时候用什么消化？有些人说用胰酶，有些人说用胶原酶，哪个适合？消化一般需要消化多久，什么程度才算消化完全，用什么终止消化，应该不能用血清来终止吧？传代的离心的速度与时间跟换液一样吗？重悬需要吹打充分，成单个散在的细胞吗？
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实验菜鸟没办法，好多东西不懂，以上问题比较多，迫切能得到解答，万分感激，如果有tumor shere formation assay 的实验protocol那就更好了，谢谢！！！

深海寂寞鱼

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To hangze037战友：
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+ g. w: b- B4 i& G& C& Q2 [% t- b     1. 从你的描述看你想从培养的细胞系中富集CSCs，这个问题本身就是个问题，细胞系中是否存在CSCs是有争议的，而且即使能从细胞系中富集得到悬浮生长的TumorShpere，这样的细胞是否具有肿瘤干细胞的全部特性也很难保证。所以实验条件允许的话，尽量从原代肿瘤组织中富集。具体这方面的问题干细胞大牛Irving Wessiman曾经写过一篇综述的。你可以找来看看。* }0 a3 }& L, A) ^' N2 o- V

9 H5 F; d4 f4 [8 C) [     2.接种前细胞用PBS重悬是有必要的，甚至可以考虑用PBS洗1-2次。至于接种后时不时去晃一晃是没有太大必要的，非常辛苦但对实验结果没有太大影响。如果你们经费允许就用低粘附培养皿。( P# z; }' ?) T( A8 D# ]

7 {% p9 d2 H$ r: \+ s0 G     3. 换液可以用离心法（800 rpm，3-5min），也可以用自然沉降法。离心的话是有可能会离心一些死细胞下来的。自然沉降法根据TumorShpere大小确定时间，基本上肉眼可以看到TumorShpere沉降到离心管底。沉降法会丢失一些细胞。所以两种方法各有利弊，你自己权衡。
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     4. 传代的话，机械吹打和消化法都可以的。消化的话我个人比较喜欢中Accutase，很方便也很温和。如果只是普通传代，不是为了后续实验的话，吹打和消化程度都不用太彻底，差不多就行，但是我喜欢单细胞率高一些，因为这样传代后各瓶/皿的生长速度会非常均一。如果你传代的目的是要进行后续实验的话，尤其是定量实验的话，建议单细胞率在90%以上吧，这样实验的稳定性会很好。' ~- F2 h! w4 ]  n* H: I" _
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    谁都是从菜鸟过来的，多多读文献吧。你要的东西文献里面都有。
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    祝实验顺利！

hangze037

回复 深海寂寞鱼 的帖子/ p% a( i5 n9 w* ^8 b- Y
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非常感谢您的建议！回答的非常具体细节, j9 V6 c0 j/ M/ o" C! ~& j
我还想请教两个问题：# F$ M8 \6 T6 x# n3 ?( [# j
1.单纯培养过程中的换液，离心后重悬时吹打力度如何把握，才能避免打散已经形成的肿瘤球？2.Accutase是怎么用法，是需要先离心去掉旧的培养基，然后再添加进细胞吗？还是直接加进旧的培养基中？一个六孔板的细胞需要多少的Accutase？一般需要消化多久？如何中和？! D& w) \* T* J: N! l
谢谢！

深海寂寞鱼

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1. 我一般是加入新的培养基，然后用指尖Tap离心管底部，细胞自然就重悬了，基本上不用枪头吹打。
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2. Accutase和其他消化液用法类似，只是可以不用中和。我是离心收集细胞后，弃掉培养基，直接加入Accutase重悬细胞，37度消化。
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3. Accutase我基本上加到能把细胞重悬起来为止。比如10 cm皿收集的细胞加1 ml Accutase重悬。6孔板一个孔 200 ul -500 ul都可以，我一般细胞稍微多一点。消化过程中间会用指尖tap离心管底部，让细胞充分重悬。

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学习啦！

lily132

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你好，请问你做的是什么细胞系？消化传代后细胞增殖了吗？我做U251细胞，用tryple 或胶原酶，消化后几天，细胞就死了啊。ACCUtase 会比tryple 或胶原酶温和吗？

深海寂寞鱼

回复 lily132 的帖子7 ^& k' S/ Z3 k# L* w2 k

- S; g* z) ~3 O4 ]: @! {( w非常抱歉，才看到你的帖子。
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; o2 t+ D+ B5 n; x9 uU251时无法长出来非常漂亮的肿瘤球的。
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6 R0 i) [: o" v0 B$ ~8 }7 K7 {; u你可以试试U87，这个细胞系比较容易。