CAR在NK细胞中的应用

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摘要：NK细胞对肿瘤细胞的裂解不需要提前致敏或HLA配型过程，因此在肿瘤免疫治疗中具有诱人的应用前景。CAR能有效提高多种恶性肿瘤相应的淋巴细胞的活性。CAR由胞外识别结构域（一般是可变的小片段），靶向特定的肿瘤抗原，并与一个或多个负责激活淋巴细胞的胞内结构域连接而成。目前，绝大部分的CAR都表达在T细胞中以CAR-T细胞的形式应用。但NK细胞同样也能表达CAR并对多种恶性肿瘤进行治疗，该方法也渐渐受到关注。CAR介导的抗肿瘤活性已经被应用于多种NK细胞，包括NK细胞系，外周血来源NK细胞和多能干细胞分化而来的NK细胞。本文将对NK细胞中表达的CAR进行综述，并比较不同胞外结构域和共刺激结构域组合的效果。
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关键词：抗原嵌合受体，NK细胞，肿瘤免疫治疗，NK-92细胞，诱导多能干细胞( g' |$ u- @% T) E: y0 Q6 f

+ T) I  `9 I/ O8 r# ?4 p' q前言
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NK细胞是先天免疫系统的重要组成部分，它不需要提前致敏或HLA配型即可裂解被感染的和恶性癌变的细胞。NK细胞也在肿瘤发生发展的早期免疫反应和免疫监视过程中有重要的作用[1]。NK细胞通过多种细胞表面受体包括NKG2D，CD16（ADCC效应介导受体）以及天然细胞毒性受体NKp44，NKp46，NKp30识别被感染的和恶性癌变的细胞[2]。这些受体激活含有ITAM结构的调控蛋白DAP10，DAP12和CD3ζ，ITAM结构能启动细胞毒性颗粒蛋白的释放并调控IFN-γ和 TNF-α等细胞因子和趋化因子的分泌[3]。更重要的是，NK细胞介导的细胞毒性作用不依赖自身HLA分子的递呈。因此，NK细胞可以用于异体源性的细胞产品而在肿瘤的免疫治疗中具有重要的应用前景。另外，单倍同一性的NK细胞在临床上已经展现了对难治性急性髓源性白血病的长期疗效[4]。NK细胞对包括乳腺癌和卵巢癌的实体瘤的临床试验也展示了其显著疗效[5]。目前，NK-92细胞系[6]和脐带血来源的NK细胞[7]均已进入临床试验阶段（NCT01729091，NCT02280525）。0 y9 S- J5 g! B3 Q, R' v2 @$ ~( M
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CAR是基于抗原抗体识别作用，人工合成用于激活淋巴细胞的蛋白，尤其是T细胞。CAR包含一个与多种胞内信号分子融合的单链可变片段（scFv）。其中scFv片段主要功能是识别高表达或者特异性表达于肿瘤细胞的抗原。胞内信号结构域在一代CAR中主要是CD3的ζ链[8]。二代CAR将CD28，CD137或CD134等共刺激分子和CD3ζ连接使用，用于提高T细胞的激活和增殖功能[9, 10]。最后，三代CAR载体采用了多种共刺激分子与CD3ζ共同作为胞内信号结构域[11]。CD19 CAR-T细胞对B淋巴细胞恶性肿瘤治疗的成功引发了CAR-T细胞的研究热潮，研究人员纷纷对CAR载体的设计和不同靶点的CAR进行效果评估和探索[12]。尽管CAR-T细胞的发展对肿瘤免疫治疗具有里程碑式的意义，但依然存在一些缺点，其中最为致命的就是自体细胞的收集，另外还有就是长时间的T细胞存活容易引起脱靶效应，从而引发B细胞耗竭等不良副作用。
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NK细胞因为不需要进行HLA配型，因此也被认为是肿瘤免疫治疗中和T细胞有同样应用价值的细胞类型[13]。临床试验显示，异体NK细胞在患者体内能存活数周甚至数月[4, 13]。另外，NK细胞的CAR表达能有效将NK细胞重新靶向那些一般情况下对NK细胞有效的抗性血源性肿瘤细胞（尤其是急性髓源性白血病细胞）。因此，NK细胞近来被用作靶向性强的异体多能细胞对难治性恶性肿瘤的治疗而备受关注。以下我们就NK细胞中的CAR载体和激活结构域进行探讨。
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NK细胞系中的CAR+ o' W1 m, ^" X" Q

! l! X& J4 ^: J" I) I7 v0 ZNK细胞系目前已经尝试表达过多种抗原靶向性的CAR。应用最为广泛的是NK-92细胞系，该细胞系已经完成过一些临床试验[6]，同时也有多个临床试验正在进行(NCT00900809, NCT00990717)。其它NK细胞系还有NKG, YT, NK-YS, HANK-1, YTS和NKL等细胞系[14]。NK细胞系与NK细胞相比具有一些显著优势，包括其均一性。另外，NK细胞系的特性已经非常清楚，不需要像NK细胞一样进行分离。同样NK细胞系相比NK细胞也具有一些缺点。比如NK-92细胞系丢失了一些典型的NK细胞激活受体CD16、NKp44、NKp46的表达[15, 16]。除此之外，NK-92细胞系来源于非霍奇金淋巴瘤患者，具有潜在的Epstein–Barr感染风险[17, 18]。因此，出于安全考虑，NK细胞系的临床应用最好是辐射灭活过的。
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大部分用于NK-92细胞中表达的CAR都是仅有CD3ζ结构域的一代CAR载体。CAR中的scFv片段有靶向CD20、CD19、ErbB2、GD2和CD138的[19, 27]（表1）。除了靶向细胞表面蛋白，CAR还能识别HLA-多肽分子复合物，比如HLA-A2与黑色素瘤抗原gp100的复合分子[28]。目前，B细胞恶性肿瘤的靶向性CD19-CAR和CD20-CAR主要是在T细胞中表达。但在NK-92细胞中，CD19-CAR与CD20-CAR载体的区别仅仅是跨膜区域的不同，采用的分别是CD3ζ的跨膜序列和CD8的跨膜区序列。但没有直接对比的情况下，无法判断哪一个跨膜序列更有效。还有一项研究报道用的是来源于HLA-A2分子和CD3ζ的联合跨膜区，这也说明NK-92细胞中表达的CAR的跨膜区具有较大的可操作性，对CAR的表达和功能几乎没有影响。但有趣的是，表达CD16分子的NK-92细胞表达CD20-CAR后对CLL细胞的ADCC效应比NK-92细胞通过rituximab抗体的ADCC效应还要强[21]。这说明，仅仅是一代CAR就能使NK-92细胞的ADCC效应提高一大截。但需要注意的是，NK-92细胞需要转染表达CD16后才有ADCC效应。这也使得PB-NK细胞有可能成为ADCC效应的更好选择。
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表1. 在NK细胞系中的CAR载体列表
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8 q, z! [8 B  O! G  P/ h  j表达一代CAR载体的NK-92细胞还可以很好的靶向实体瘤抗原。研究发现，ErbB2-CAR能显著提高NK-92细胞对HER2阳性的乳腺癌、卵巢癌和鳞状细胞癌的杀伤能力[23]。该研究还发现，在老鼠皮下移植瘤模型体内试验中，表达ErbB2的NIH3.3细胞与NK-92细胞的混合细胞能有效抑制肿瘤的生长[23]。仅含有CD3ζ跨膜区的一代GD2-CAR能有效靶向原代胶质瘤细胞以及GD2阳性的黑色素瘤和乳腺癌细胞[26]。另外，一代CD138-CAR也能有效靶向多发性骨髓癌[27]。值得注意的是，在老鼠移植瘤的治疗中，表达CAR的NK-92细胞比对照NK-92细胞更显著的延长小鼠生存期，但对CD138阴性的细胞移植瘤的治疗没有上述差异[27]。这些研究充分说明，一代CAR能有效诱导提高NK-92细胞的体外以及老鼠模型上的杀伤能力。尽管如此，皮下移植瘤模型与患者体内肿瘤微环境存在很大差异，因此，皮下模型的成功不代表NK-92细胞在患者体内的疗效，有待进一步验证。2 b$ {4 w- q2 p" p* R; x  y5 m5 x

9 h, i' Z+ F7 o/ L4 g二代CAR除了CD3ζ链之外，还连接了第二信号分子，大幅延长的CAR-T细胞的存活时间[9]。这也驱动了二代CAR在NK细胞中的使用。与一代CAR相似，各种scFv片段被用于二代CAR的制备，包括靶向乳腺癌和卵巢癌的EpCAM片段[30]、靶向Epstein–Barr病毒的HLA-A2/EBNA3C复合片段[31]、靶向MM的CS1片段[32]以及靶向HER2阳性肿瘤细胞的ErbB2片段[24, 25]。NK细胞中最常见的组合是CD3ζ与CD28分子的组合构建而成的二代CAR。但正常的NK细胞一般不表达CD28，因此表达CD28对NK细胞的影响还未尽知[35]。另一种NK细胞中表达的二代CAR是CD3ζ与CD137的组合形式。与一代CAR相似，二代CAR能有效将NK细胞靶向多种类型的肿瘤靶细胞。与CD3ζ单独或ErbB2单链片段相比，CD28/CD3ζ, 与CD137/CD3ζ的效果不相上下，但均优于一代CAR[25]。除此之外，还有研究者将CD8α信号肽中的丝氨酸定点突变成半胱氨酸，并发现能有效提高NK-92细胞表面的CAR表达。最后还比较了CD28/CD3ζ组合与DAP12单组分对靶向前列腺癌的PSCA-CAR在YTS NK细胞中的功能[34]。研究发现，DAP12单组分的PSCA-CAR比CD28/CD3ζ组合的PSCA-CAR能更好的介导YTS NK细胞对表达PSCA的293T细胞的杀伤作用，表明在NK细胞系中，DAP12片段可能更优于CD3ζ链[34]。9 L" {+ {9 r7 A$ U: j

, h/ U1 U/ \* o! o$ x4 ?CAR在PB-NK细胞中的应用
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CAR也已经被用于在外周血来源的NK细胞中表达。与NK-92细胞不同，PB-NK细胞激活后表达一序列相关的受体，包括CD16、NKp44、NKp46和KIRs，这些受体在NK细胞发挥功能过程中非常重要[36]。除此之外，PB-NK细胞在治疗应用时也不需要进行辐射灭活，因此使得PB-NK细胞能在体内增殖，这与PB-NK细胞在AML治疗中的显著疗效密切相关[4]。各种形式的CAR被用于PB-NK细胞中表达并进行效果对比，包括靶向CD19[37-39]、CD20[33]和ErbB2的各种CAR[40, 41]（表2）。Imai等人研究了DAP12和CD3ζ的一代CD19-CAR以及CD137/CD3ζ组合形式的二代CD19-CAR，并发现与CD3ζ相比，DAP12介导的一代CAR在PB-NK细胞中的效果较弱，CD137分子的使用增强了 PB-NK细胞对RS4:11 和 380ALL细胞系的杀伤作用[37]。另一项研究比较了CD3ζ、2B4、2B4/CD3ζ、CD137/ CD3ζ形式的CD19-CAR对白血病细胞系REH的杀伤能力。体外实验结果表明，2B4的一代CD19-CAR比CD3ζ的一代CD19-CAR活性略逊一筹，二代的CAR均优于CD3ζ单组份的一代CAR，但2B4/CD3ζ和CD137/ CD3ζ形式的二代CAR效果相当[38]。当比较CD3ζ与2B4/CD3ζ形式的靶向神经细胞瘤GD2-CAR时，2B4/CD3ζ组合形式同样优于CD3ζ单组分形式的CAR[38]。还有一项研究比较了CD3ζ单组份和CD3ζ/CD28组合的ErbB2-CAR。虽没有进行杀伤能力的比较，但两种CAR介导PB-NK细胞的INF-γ分泌水平相似[41]。当从不同的角度比较时发现，CD3ζ/CD28组合对CAR在PB-NK细胞中的活性没有提升作用，但对其在NK-92细胞的活性有显著提高，这表明，同一种CAR对PB-NK细胞和NK-92细胞的激活效果不同。- y! Y! c) Z9 ]  T3 l! S
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表2. 在PB-NK细胞中的CAR载体列表
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4 v+ o. J+ O; w6 ~% G  }8 R另一种比较特殊的CAR制备方法是采用NK细胞的激活受体NKG2D的胞外区域与CD3ζ进行连接[42]。这种CAR采用了普遍高表达于肿瘤细胞的NKG2D配体对CAR进行激活。另外，NKG2D与DAP10联合可以作为第二信号分子。事实上已经证实了DAP10与NKG2D/CD3ζ的联合使用能提高CAR在NK细胞中的表达量。这种CAR对多种恶性肿瘤的效果已经试验过，效果最好的是ALL，骨肉瘤、前列腺癌和横纹肌肉瘤[42]。! k: \- m  m( \+ V7 }9 T* k$ W/ b- l

2 ?' i( f/ z6 ]. y% I除了NK细胞系和PB-NK细胞外，多能干细胞（iPSC和hESC）诱导分化而来的NK细胞也适用于表达CAR载体[43, 44, 48]。这种NK细胞和PB-NK细胞表型相似，但其来源细胞，即多能干细胞可以大量体外扩增，甚至能达到临床应用的数量级[48]。研究发现，表达CD4/CD3ζ的iPSC-NK细胞能有效抑制HIV病毒的增殖[49]。这些研究中，研究者首先制备表达CAR的iPSC细胞，再进行诱导分化形成表达CAR的iPSC-NK细胞。表达CD4/CD3ζ二代CAR的iPSC-NK细胞对HIV病毒的增殖抑制作用为CAR在iPSC-NK细胞中的应用提供了良好平台。而且，iPSC-NK细胞能与表达NKp44、NKp46和KIRs受体的PB-NK细胞和NK-92细胞混合使用，并未显示有分化不彻底的iPSC或者T细胞带来的困扰。除此之外，hESC-NK细胞或iPSC-NK能更好的进行非病毒介导的CAR基因转染操作。这与PB-NK细胞很难稳定表达CAR载体形成鲜明对比。2 B. ?5 u: b. G+ n

4 w: X: ^( {  H+ O, G$ \, M! d: s结论  f& m* K' r: p0 V+ a* S( c

/ q7 B1 A" Z9 K7 \  j尽管CAR在NK细胞用的应用备受关注，但依然也存在一些问题有待解决。最重要的可能还是最有效介导NK细胞杀伤能力的CAR载体的制备。目前对于一代、二代CAR在NK-92细胞和PB-NK细胞的对比研究非常有限。但依然可以初步断定，在PB-NK细胞中，二代的CAR优于一代CAR。CD3ζ优于DAP10[37, 38]。在NK-92细胞中，DAP12形式的CAR优于CD28/CD3ζ形式的CAR，但不确定的是，NK-92细胞系的结果是否能在PB-NK细胞和hESC/iPSC-NK细胞中重现。由于NK细胞本身不表达CD28，CD28在CAR中的表达对NK细胞的影响也不清楚。不同类型的肿瘤或抗原需要不同的CAR来介导NK细胞对其杀伤。不同形式的胞内外结构域的直接效果比较对解决上述问题有巨大帮助。
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还需要更多的研究来进一步验证NK细胞系，PB-NK细胞或iPSC-NK细胞表达CAR载体是否真的能为临床患者带来益处。表达4-1BBL/IL-15分子[52]和mbIL-21分子[53]的两种人工APC细胞都可以用于对PB-NK细胞或iPSC-NK细胞进行的大量扩增[48]。因此，NK细胞的数量不成问题。但尚未尽知的是，APC诱导扩增而来的NK细胞是否能有效用于临床治疗，表达CAR的PB-NK细胞制备依然有待完善。iPSC-NK细胞由于其来源不具有任何问题而在临床应用上具有明显优势。不管怎样，CAR载体的重组以及外源片段的插入等操作需谨慎完成。不表达一些典型的NK细胞受体的NK细胞系在使用前务必进行灭活，这一点也限制了NK细胞的体内扩增和生存。
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0 d8 X4 V2 K0 a; i0 ^- LCAR载体的转染也是一大难点。目前常用的CAR载体转染介质是逆转录病毒和慢病毒。但对于NK-92细胞系来说，转染后需进行细胞筛选获得稳定表达CAR的细胞群。PB-NK细胞的CAR转染表达效率最高达到69%，但也低至13-24%，一般效率在50%左右[38]。对iPSC-NK细胞而言，表达CAR的NK细胞诱导是技术难点，对iPSC细胞主要是通过转座子进行细胞核转染，如此可以避免病毒载体引起的一些潜在风险。另外需要考虑的就是，尽管NK-CAR细胞的存活期仅为数周，但期间如果出现毒副作用是否应该采用Cas9或TK自杀基因系统对其进行控制[14]。, l, O2 j" A) S7 g% D) A# _

" G1 h, O3 A- X; a尽管存在上述问题，CAR-NK细胞在恶性肿瘤以及慢性感染疾病的免疫治疗中具有广阔的应用价值。CAR-T细胞在ALL和CLL治疗中的巨大成功对肿瘤免疫治疗的发展具有里程碑式的意义。而CAR-NK细胞的研究以及应用在CAR-T细胞的基础上可能走的更远。NK细胞主要优势在其均一性、非HLA限制，在患者治疗中具有更快、更简便等特点。因此也省去了CAR-T细胞治疗中的患者自体相关的一序列繁琐才做。有效的采用CAR载体介导NK细胞对肿瘤细胞的毒性杀伤作用有望将肿瘤免疫治疗进一步推向巅峰。
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- l2 B) J1 q4 y# u% |信源：Utilizing chimeric antigen receptors to direct natural killer cell activity

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拉二胡的拉尔夫

汇总的实在是太好了，已经收藏