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标题: 如何将细胞单克隆挑下来 [打印本页]

作者: zoe 时间: 2010-12-16 10:00 标题: 如何将细胞单克隆挑下来

在培养皿中的贴壁细胞，如何将细胞单克隆挑下来？

作者: starlancer 时间: 2010-12-16 11:00

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稀释法或者显微操作，虽然后者有点杀鸡焉用牛刀的感觉。我能想到的是这两个，不知道还有啥别的方法

作者: kostarcell 时间: 2010-12-16 11:19

高压过的棉签蘸下来，把棉签放在50ml离心管，离心管放饭盒里去高压。我忘记棉签是不是蘸一点稀释的胰酶了…… 你自己试试吧

作者: zoe 时间: 2010-12-16 14:57

如果用克隆环呢，好操作吗？

作者: yezi_830823 时间: 2010-12-16 15:57

我觉的用克隆环不是很好操作，它总是漂起来，还不如用显微操作呢

作者: zoe 时间: 2010-12-16 18:26

显微镜下用枪头吸出来后直接吹散接种，还是要用胰酶吹散？

作者: wxyWXY 时间: 2010-12-16 18:43

用胰酶吹

作者: 大刀无敌 时间: 2010-12-18 00:43

挑单克隆就是用白枪头挑的，然后胰酶消化。

作者: qingbao 时间: 2010-12-18 02:08

如果是带荧光标记的就很好挑（没有标记的就稍难一些），在显微镜下找到，在培养皿底部相应位置做上标记。至于用不用胰酶需要看具体细胞株而定，比如像293这样的细胞就不需要胰酶，其他贴壁牢的细胞则选用胰酶。

作者: Temin 时间: 2010-12-18 10:47

我们是这样做的，我觉得比较简单，但是较为考验操作技术，不过多挑几个培养皿，熟悉一下就能挑到很多的克隆。简单的来说，是这样的：首先转染后的细胞（或者其他细胞系）按照一定的比例稀释到100mm培养皿（比如1:50,1:100,具体根据那种细胞生长速度的快慢而定，保证之后长出的单克隆与单克隆之间有足够的间隙空间，方便挑克隆），加抗生素选择性培养，大概一周到两周（视细胞系而异）后能长出肉眼可见的细胞单克隆，不是很清晰，但在超净台中对着日光灯能看清楚的；这时准备挑克隆了，准备一块96孔板，加上100ul/well培养基；准备一盒灭菌后的200ul普通黄枪头（20ul的白枪头我试过不好用）；先吸掉培养皿里的培养基，用PBS润洗一遍细胞（要是熟练了挑克隆的速度比较快，我们也直接用胰酶润洗，另外对一些难消化的细胞，用胰酶润洗的效果比PBS好），再用100ul移液枪调到20-30ul量程，吸取大约10ul左右胰酶，在日光灯下对着细胞克隆吹打并吸取，加到96孔板中即可。
刚开始用这种方法，可能吸不上细胞，导致整个96-孔板可能基本上白板，没几个克隆被挑出，但多练习几次就可以了，基本上一吸一个准；不过，这种方法容易导致克隆不纯，这也是为什么之前克隆稀释的时候要按照一定的比例，保证克隆与克隆之间有足够的间隙；但是，还是不能保证克隆很纯，在鉴定出阳性克隆之后，如果觉得有必要，克隆到时候再做一个单克隆稀释。( X a6 {% b% N
我们用这种方法很久了，觉得比较有效，已经成功构建了很多的细胞系。

作者: zoe 时间: 2010-12-19 00:21

能否在显微镜下直接用枪头把贴壁细胞吸出来或刮下来，然后再用胰酶吹散？

作者: cicadacjk 时间: 2010-12-19 10:39

用玻璃巴氏管拉成细针，稍微融下头部，可以很好地在显微镜下分离克隆
然后用口吸管吸就可以了（胚胎操作的都会）( @( s& v$ w: ]: _, {, V1 {2 y
见到的其他方法都没这个精确

作者: st_oliver 时间: 2010-12-19 11:05

回复 zoe 的帖子- j/ }- h1 l) ~5 o2 C+ G

本人最近一直在挑克隆，挑的眼睛都花了，荧光的和没有荧光的都挑过。
有多种方法7 V$ n8 |2 D! k2 }6 o& m. [+ F4 ~1 |
如果你的克隆比较大，且比较稀疏，皿又比较大，想批量操作的话，可以用小的滤纸片原片，泡过胰酶的，消化，然后一个滤纸片放在一个96孔板进行扩培！
如果你的克隆比较小，又密的话，上面的方法就不行了，我主要用吸胚管拉细了用，根据你的克隆大小拉成合适的孔径，可以先用胶原酶消化下来，取少量稀释到合适的密度，吸胚管吸出你要的克隆，可以胰酶消化，也可以暂时不消化，时间操作要快。也可以不用胶原酶消化，直接刮下克隆，吸出你的克隆，进行下一步处理。
要挑比较纯的克隆，就看你的稀释程度和你的操作技巧了，多多练习就好了。) d" B+ F2 F! f3 Z
最好祝你实验顺利噢！

作者: zoe 时间: 2010-12-21 08:57

非常感谢各位前辈，我会尝试下，有结果了上来回报，祝各位前辈实验顺利

作者: trl137 时间: 2010-12-24 00:11

我们经常用的是显微操作法和稀释法。具体这样做的：" H! W! `$ u& Y$ n( t. C
稀释法：等细胞生长到一定密度时，传代稀释，在一个10cm培养皿中，细胞数保持在20个左右，这样等到细胞长起来后，彼此间有一定的距离，再用克隆环就可以得到了。1 _5 S1 `( d6 l) R0 M
显微操作法：只需要把显微操作注射针的直径控制约为体细胞的大小即可，消化细胞后进行显微操作。

作者: janeyu 时间: 2011-1-11 16:22

如果克隆不是很密集的话，可以用在显微镜下观察，用记号笔在培养皿下点一下做个标记，然后拿到操作台里挑取，办法很土，却是可行的，我们实验室的单克隆就这么挑取的。
如果克隆长的比较密的话，建议用有限稀释法稀释到单细胞再培养克隆。

作者: siyue13 时间: 2011-1-11 20:18

用克隆环

作者: BIOLOGY 时间: 2011-1-11 20:40

体视镜下，把克隆用玻璃针管连着一段橡胶管做的口吸管吸出，胰酶消化，血清终止，种入新的皿中即可

作者: future007 时间: 2011-1-14 11:03

我见过两种，都是需要先在显微镜下用笔将克隆圈住。一种是用克隆杯，底部抹上凡士扣在画好的克隆处，用胰蛋白酶加到克隆杯里消化，在终止消化，最后吸出液体传代。另外一种就是直接用枪头反复划圈住的克隆的区域，用PBS轻轻地从皿的一侧冲洗。最后收集PBS液，直接传代到新的皿里，不要忘了补加细胞培养液。

作者: jhu132llh 时间: 2011-1-14 11:58

这个在我们大实验室其他组倒是很容易
因为我们大实验室有做克隆的8 o' ?- f. L6 P: W _) \# O$ t
所以6 Q* [# U0 V& Z# N, ?
用遗传操作系统很容易就可以将细胞克隆吸出来，极度精确

作者: bin 时间: 2011-5-23 10:49

即将要用到的技术，还不会，谢谢各位了。

作者: bin 时间: 2011-5-23 11:08

,看来这似乎是个难关耶。

作者: BIOLOGY 时间: 2011-5-23 13:16

用玻璃针挑比较好，而且能吹的很散

作者: 宗介 时间: 2011-5-25 01:08

加胰酶用枪头吹

作者: chliu 时间: 2011-5-26 09:00

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我们是先用PBS洗两次，加入PBS，在解剖镜下用20ul的枪头将单克隆整个挑起来，吸至枪头中，加入已经加好胰酶的96孔板中，用胰酶消化。

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