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标题: VSVG质粒 [打印本页]
作者: shewawa    时间: 2011-1-6 16:13     标题: VSVG质粒

请教下，
7 {. I- o" c+ e: t1.VSVG是什么？是什么病毒的质粒吗？; X3 y5 a5 r0 Q. T* }
2.这个病毒怎么侵入宿主并且复制的啊？是破坏细胞膜结构吗？2 |3 v; `8 _$ ?$ |1 J
3.VSVG质粒转染后，通过plat-e细胞产生的病毒感染细胞的种类，包括人类细胞吗？
作者: markllq    时间: 2011-1-6 16:50

1. VSVG是一种包膜蛋白（病毒正是通过包膜蛋白与宿主细胞识别，然后进入细胞），全称是疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G，因为这个蛋白具有广泛的宿主范围，因此我们在改造病毒载体的时候经常用这种包膜蛋白代替原来病毒中宿主范围较小的包膜蛋白。
+ c& B: w- I2 K3 {: X! A2 G" t5 B2. 受体介导的内吞作用，不会破坏细胞膜。" h3 L2 j5 {7 y, \/ d1 ^4 }
3. 通常将VSVG基因克隆到特定载体上作为包装质粒，与目的基因同时转染293T，产生的病毒颗粒可以感染多种人的细胞。
作者: shewawa    时间: 2011-1-6 18:40

回复 markllq 的帖子  n2 y' p2 p" O1 }5 C" a" g/ v
: K. f( ^1 q% }5 p$ M3 w6 F3 z
崇拜ing……Thanks very much.还想弱弱的问问，是不是就是说被这个VSVG病毒颗粒感染后的细胞是不是就会变成1.上说的广泛宿主细胞呢？？我就可以用这个被VSVG感染的宿主细胞去感染很多原本不能感染的病毒了呢？？？打个比方，仙台病毒不能感染人细胞，那么被VSVG感染后的人细胞是不是就可以感染仙台病毒了呢？还请麻烦赐教~~
作者: markllq    时间: 2011-1-6 19:33

回复 shewawa 的帖子/ g) \7 Q5 L+ D6 ]* @" C/ `
/ ?1 G' k. Q1 s
    不是这样的。" {/ R" R! Q( W& K; Z
   首先你清楚我们在做转染的时候，并不是将所有的病毒元件一次性转进去的，考虑到安全性，我们将将病毒的元件分为几个部分。举个例子：逆转录病毒主要包括三种核心蛋白，gag（核心蛋白基因），pol（复制、整合酶基因），env（表面抗原），通常将gag和pol整合到293中，env克隆到载体上作为包装质粒，目的基因插入到含有病毒的3‘LTR及5’LTR的载体中，这样转染以后在宿主细胞中三种蛋白同时表达组装成为一个完整的病毒。' M+ B' w' X% D- a4 ?1 y' H8 G9 l
   很多病毒的env的宿主范围很小，只能感染少数种类的细胞，而VSVG是一种宿主范围很广泛的env，之所以说它就有广泛的宿主范围是因为这种抗原可以在很多细胞表面都能找到对应的受体，从而病毒可以通过内吞作用进入细胞。而宿主细胞被感染后表面受体的种类不会并不会发生改变。
* m5 \$ w: u8 W$ C- ~" w5 Y   不知道我说清楚没~
作者: 天山水    时间: 2011-1-6 19:44

太给力了！！
作者: hcluo    时间: 2011-1-7 09:02

我们实验室构建的病毒载体，包括VSG-V（包装蛋白），pVpack-GP（整合蛋白），MMLV（目标蛋白）。三个质粒安装一定的浓度混合转染目标细胞，就可以了。
作者: shewawa    时间: 2011-1-7 09:55

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- M  N$ y- g) S+ q. g  o$ i0 S+ p7 m9 l& r8 I
GREAT！！！说的真是太爽了！不怪人家说我没文化呢，无比佩服了！！！2 J& x- f  U" _( q9 h4 X( @1 K
讲的很明白但是本人无基础，还想再请教下：$ h( f5 z6 c! @9 G
我在CSHL上的Principles of Retrovial vector design上面看到这句话
- r6 ?2 q' {# R& TRetroviral env proteins replaced with the VSVG protein produce retroviral vectors with broad host range and improved virion stablity which allows concentration of the vectors to high titer.……
; J5 m: n7 ?* Q" i这是不是就是说将上面说的retrovirus的env换成VSVG我的Plasmid产生的病毒就可以感染很多的宿主了？？？那我制造出来的病毒还是retrovirus了吗？
作者: shewawa    时间: 2011-1-7 10:01

回复 hcluo 的帖子+ E+ y/ l% \% Z) P5 E; V
% G2 @+ W1 o8 O3 o9 E; M( Q
Thanks.
& A4 T3 j# y  Q% P( _, @: H( v请问是说将上述的三个蛋白质粒转染产生病毒，再加上我想加入的其他目标质粒M转染得到的病毒就可以一起导入到target cell 里面了是吗？
作者: markllq    时间: 2011-1-7 11:20

回复 shewawa 的帖子  d4 J+ \+ H: f$ r% u" }

# ~  B' l" }$ I. [' V2 I嗯，就是我说的那个意思，出来病毒当然是逆转录病毒，只是我们把其中的某个元件换了一下变的更实用了，你把联想电脑的鼠标换成惠普的，能说这电脑就不是联想了的吗？呵呵，再说不管它变成啥样了，是要符合我们的实验要求就是王道，比如，慢病毒就是从逆转录病毒改造来的，有很多优点，它能携带更大基因而且能转染非分裂期的细胞。
作者: markllq    时间: 2011-1-7 11:21

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& s- x8 {0 F6 `
2 {4 t* F1 V$ \# h7 h它们共转染可以实现含有目的基因的病毒的包装
作者: hcluo    时间: 2011-1-7 11:25

回复 shewawa 的帖子) }2 Y7 V" ?* Q1 P4 j! v

2 {3 k& e0 f7 ~6 o$ y/ M理论上是的，但是基本上要保证你的目标蛋白的质粒中带有病毒导入的LTR长序列。另外，还需要加一些介质，如DEAE葡聚糖之类的东东吧。
作者: shewawa    时间: 2011-1-7 11:45

本帖最后由 shewawa 于 2011-1-7 11:46 编辑 * `' a8 [. r, R( n1 B, F" C% `

9 ?; U9 g+ T0 l% ^) q! @回复 markllq 的帖子
- `4 B0 h3 v3 {8 s; c/ y  u: o
9 ^0 t: H+ }. ^& M" l哦，原来如此，差不多懂了，谢谢哦。等做了试验不懂的时候再请教哦，谢谢~~
# C4 D7 L, t4 Y& @% K顺便说下，头像很可爱，好像新概念上的小图
作者: shewawa    时间: 2011-1-7 11:49

回复 hcluo 的帖子, R' G% b  a0 t7 [

' b3 r* e& S* uDEAE葡聚糖，一头雾水，这个不懂~~~看来得在学习学习了。。。
: `# R" o0 r( u/ Y  n1 n) G9 ^我觉得我这只有fugene6 和HD，剩下就是293T细胞之类的了我就做做看吧，遇到问题了再次请教，谢谢
作者: hcluo    时间: 2011-1-7 13:50

DEAE-葡聚糖介导的高效转染的一种方法，应该可以查到的
作者: regene    时间: 2011-1-10 08:39

回复 markllq 的帖子/ F* M( ~6 {# E: _" ]1 R
! Z" T1 B4 s! d0 Y/ J; C
1. VSVG是一种包膜蛋白（病毒正是通过包膜蛋白与宿主细胞识别，然后进入细胞），全称是疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G，因为这个蛋白具有广泛的宿主范围，因此我们在改造病毒载体的时候经常用这种包膜蛋白代替原来病毒中宿主范围较小的包膜蛋白。; @. I0 e4 ~8 D% `% v# R3 }
2. 受体介导的内吞作用，不会破坏细胞膜。
4 U( z' v( M% i+ t) h, N
& I6 E+ V3 _9 J( P* S% {请问“ 受体介导的内吞作用”，是说 VSVG可与细胞膜上的特定受体结合，介导内吞？还是其他的机制？谢谢指教～
作者: markllq    时间: 2011-1-10 11:27

回复 regene 的帖子
7 l. W1 H9 t$ X( G) N
3 b, {9 I2 {6 B! f4 }7 |3 E对，我的理解是这样
作者: smkx    时间: 2011-1-15 21:33

在研究中
作者: robbinchen    时间: 2011-5-12 10:55

病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％,自身基因组指的什么?其次,一般来说,慢病毒的插入大小不超过8k.我想知道这8K是纯粹插入的片段,还是LTR之间只能是8k?想问一下,pll3.7最大能插入多大的片断?
作者: SHENJINGWAIKE    时间: 2012-4-11 16:49

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/ K! w; t) v8 P* J  Z: x% r
& E0 i  P  o0 |- B你好，你们实验室的VSVG的质粒能给我们一份吗，我是徐州医学院的研究生，用于囊泡转运的实验技术。我的邮箱是wangmeng198661@163.com
作者: SHENJINGWAIKE    时间: 2012-4-16 09:36

你们实验室的VSVG质粒，能分享吗，我的邮箱wangmeng198661@163.com
作者: ouyi2738    时间: 2012-4-24 18:24

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, [- V3 F" ]3 u  x; p
( B- U2 v* `: z5 w3 }: U; s/ \0 J3.platE 已经整合了env，只能感染大小鼠，至于转VSVG后包出的病毒能不能感染人，感染效率如何，值得商榷。最好由293T或plat gp。
作者: ouyi2738    时间: 2012-4-24 18:35

回复 shewawa 的帖子
$ P- o- A) G( D: `2 V) r* L6 G8 M0 h: d/ Q
fugene有点浪费啊，去分子克隆上找Ca转法把，对293t我们的转染效率都在90%以上
作者: ouyi2738    时间: 2012-4-24 18:39

回复 robbinchen 的帖子! I; L# i! l. _; |2 {

* E  g- ~5 F2 ]只是插入越大包装效率越低而已，我的pRRL插入了超过8k的片断，质粒超过了14k，一样可以用，滴度一般在2000+i.u./ul
作者: frankieisme    时间: 2012-4-25 01:35

我做的系统是GagPol,VSVG和带目的基因的病毒质粒按2:1:3的比例共同转染293细胞,包装出需要到慢病毒.
作者: shewawa    时间: 2012-5-31 14:18

本帖最后由 shewawa 于 2012-5-31 14:19 编辑 % q3 o4 c# _: S# S
# S+ d7 B% d4 ]* M
回复 ouyi2738 的帖子
  \, W* n  J- w0 i) f
) M! C/ s/ F: C8 K9 h关于fugene的回复：这个我们实验室换成xgene9了，据说便宜点儿。ca法我用过啊，虽然转染率很高，但不知道为什么这种方法做出来的病毒不能做出漂亮的iPS。. [5 z3 |, g0 L5 N: s0 D
PS：谢谢热情的回复~
作者: Dancmacabre    时间: 2013-7-23 22:19

最近在大提那些质粒，需要高质量的质粒做慢病毒包装试剂盒，反正不好提。
作者: sunday    时间: 2017-10-30 18:02

转染后会不会有质粒残留，若很小量的残留是不是不影响，超过多少会影响，有没有标准？



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