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标题: 转基因小鼠制备实验方法（protocol) [打印本页]

作者: HMC 时间: 2011-4-23 11:20 标题: 转基因小鼠制备实验方法（protocol)

转基因小鼠制备实验方法（protocol)6 H9 @* b/ Y) H3 O- k9 ]" _/ z3 r" s

1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG（10 IU）。- ?2 C- }+ C1 x. e8 U6 D7 U4 H" A

2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG（0.8 IU），并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠（2月龄以上）作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
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3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。/ c% ^' n# k  h. k0 ~

4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
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5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。
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6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。! k; B$ Z. t3 g' e; Q8 u9 C
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7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。) J6 D% r, }% a& l8 Y

8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。

9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。
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10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。
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(一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)
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作者: xiangchou812 时间: 2011-5-14 13:29

请问楼主“阴道口封闭”是怎么回事？是选取小鼠的标准吗？

作者: lizyue 时间: 2011-5-16 21:32

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同问。7 z' L( G8 S I8 ]
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小鼠交配之后，雌性小鼠的阴道口是被栓封闭的（“plug”）。但是楼主所说的是不是这个意思？建议楼主把英文原文贴来哦：）

作者: chliu 时间: 2011-5-25 10:10

回复 lizyue 的帖子

我认为楼主说的不是plug的意思，如果已经有plug了，就不用超排卵之后再合笼了

作者: aulenuyah 时间: 2011-5-25 23:25

本帖最后由 aulenuyah 于 2011-5-25 23:25 编辑 ! Z$ D& s' C" @8 c; w9 V5 J
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难道楼主是怕小鼠先交配了吗？？不过觉得这一步好像是没有必要的，因为小鼠都是公母分笼养的，基本交配不上

作者: 天极拾贰星 时间: 2011-6-4 20:27

aulenuyah 发表于 2011-5-25 23:25
R, M1 z& l, s% A( K难道楼主是怕小鼠先交配了吗？？不过觉得这一步好像是没有必要的，因为小鼠都是公母分笼养的，基本交配不上

阴道口封闭是指的你要超排得老鼠不处在发情期这样就不会有内源的激素干扰你的PMSG跟HCG了不过一般超排都用4W的老鼠效果会比较好

作者: aulenuyah 时间: 2011-6-4 22:32

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我怎么感觉咱们好像没说一块儿去呀

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