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标题: 【请教】外周血分单核细胞培养DCs的详细步骤 [打印本页]

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作者: wagumaxida    时间: 2012-5-17 20:55     标题: 【请教】外周血分单核细胞培养DCs的详细步骤


+ x7 a9 M7 b  ?! k% r/ j! [; w7 f, R8 d; Y, @8 ~
主要有几个问题亟待解决/ c# U9 n2 I8 j1 P7 x. u
1.外周血分淋巴细胞时，梯度离心去除血小板时，离心梯度是怎么设置的？0 U3 ~3 e0 D* Y' _: W- R) h
2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：$ v. c, }5 Y* k6 k- b" [
  A.贴壁时需要加血请吗？需要加细胞因子吗，需要的话加哪些，量是多少？
; Z! x) _  d9 Z) i/ E- r  B.贴壁时间是多长时间，2h还是48h？
) ~8 k( r5 r2 L* E  C.贴壁时是在培养瓶中好还是在六孔板里好？, ?1 t& `- d1 Y% h' ?+ l
  D.这一步还有什么要注意的吗？
! S/ r: W- Y- O, j: b3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：9 Q7 P5 }# f. Q$ u# P
  A.换液间隔怎样？半量换液还是什么其他方式？
+ `: P) c: n; e3 m5 l# K' C0 |  B.换液时所用培养液中因子的量是多少？
7 J0 a! k% u) a& L' V. _  @4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：) Z: M5 o2 S- O/ I
  A.在第几天开始诱导？
1 c( h, ]( B1 m4 X" }& Z  w/ l: l4 H  B.用什么因子或者药物进行诱导，量是多少？  t3 [( C  F) c% L. Q: o: M
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4之类的吗？
; ~3 p6 Q6 `8 R& |1 \- q- k/ i  D.诱导多长时间可以收获？
' g& x" H1 m$ G' m3 P" rP.S. 如果要用荧光腺病毒感染的话，在第几天哪个阶段感染会比较好？' k6 O* B- |9 b# B6 e) @; H( e) Q
% A- I% @# K3 u4 S$ \% E& F
非常感谢！

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作者: zhenhuale    时间: 2012-5-18 08:19

同样的疑问，培养的过程中一直存在

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作者: luoziwei    时间: 2012-5-18 09:08

持续关注

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作者: 大少爷    时间: 2012-5-18 22:14

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。4 c! S2 h0 l5 x6 m, U8 m/ E' Q
2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：2 T0 c$ v; ]  y& l( ^7 @: `
A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。3 w$ _6 Q' z  n# z* g
B.贴壁时间是2.5h
" m' c0 M7 c' ?* n. Z C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。3 ~8 D0 y; W. e) I# l$ o1 ?

+ v  f9 q1 ^" {3 h6 n3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
+ Y( {$ I, v! P A.换液间隔一到两天，半量换液; l+ o* W" K& g7 E( U* |, L$ n
B.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-46 U! G7 U, a7 }8 ?7 Z2 l
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步： / [! Y: g  o6 ~# N; C; w
A.在第五天开始诱导
0 f$ ]) x7 V$ o1 a8 N0 ]) f B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。
, D% ^/ n' p* }' r5 j7 E" z  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。; S9 f; s# v- Q, a
  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

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作者: 大少爷    时间: 2012-5-18 22:16

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。
3 \! W* ^" Y1 _" s0 K2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
; y2 W% t9 P1 A  f: f& N$ y" _: | A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。
7 a9 Y4 ~; X7 m( F  j) F1 u: n B.贴壁时间是2.5h
! d% w" I. @' h4 k3 [$ j' ]: j- } C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。
4 ~) d8 B6 q2 a3 L8 Q4 A' n. [6 y* t% d
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
9 s) v9 m9 ^! J9 G& n A.换液间隔一到两天，半量换液
: ]5 C! E1 U+ J8 ]1 g4 eB.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4
/ V6 p% ~. I5 }0 Y, B2 {2 F4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：
, J9 E3 g& p: f4 s: b( W" L A.在第五天开始诱导; C) ]6 n/ c2 d; o8 L4 b
B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。# A9 ?; k! d5 ^4 l
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。
1 H/ s, H* f1 ]  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

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作者: wagumaxida    时间: 2012-5-20 09:10

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16 " o" Q0 |" L0 j: t, g$ i& v0 J5 [" R
1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

) c' d( K) x! f& v感谢 另外收获后的维持培养也需要加细胞因子吗？ 需要加什么

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作者: hwlightning    时间: 2012-9-11 07:57

回复 大少爷 的帖子
/ e& _4 \/ n% E8 J4 D# ~
! N3 o  _6 K1 _: y4 A( `请问下GM-CSF,IL-4和TNF-α国产的就行还是要进口的？能推荐下厂家吗？

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作者: vanessa    时间: 2012-9-12 08:30

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16 / g8 K& `2 O9 ?: H1 b3 C; N& D
1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

& I! a% u# e& ^4 g( u第一步我们一般是根据淋巴细胞分离液说明书来进行操作的，一般国产和进口的Ficoll离心力会有所不一样。

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作者: hwlightning    时间: 2012-9-17 15:43

回复 大少爷 的帖子
, h+ b4 K9 O: Q; q8 _- r
; ]; \6 R3 B/ S! x& i+ E% X活性单位U与质量单位ng怎么换算啊？

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作者: 大少爷    时间: 2012-9-17 16:58

活性单位U与质量单位ng好像没有换算关系，每种抗生素好像都不一样。。。

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作者: deshenglll    时间: 2012-9-26 15:09

学习，受益。

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作者: Tevirly    时间: 2012-11-2 15:00

回复 大少爷 的帖子
$ u9 v9 T/ h) v8 x; ]
; \+ |4 j9 a: X2 p请问如果用培养皿培养单核细胞诱导DC的话，用哪个牌子的培养皿比较好呢

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作者: hwlightning    时间: 2012-12-6 15:02

回复 大少爷 的帖子
7 i. z4 a0 v. ?5 S) v. s' P( P) a; G- N: n' |0 T7 W- M9 a
请问你用的是不是PEPROTECH品牌啊) z4 _' B% }1 \8 h1 R+ V2 [" U
IL-4的浓度会不会太高了导致浪费因子。

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作者: 大少爷    时间: 2012-12-6 17:07

是的，50ng/mi5 p. n/ u) k$ Y, |8 m% w! L" Z

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作者: 细胞海洋    时间: 2012-12-7 11:09

回复 hwlightning 的帖子3 k& B) T6 h3 R  q
7 c; z$ V; R& y5 o9 Y. M
看14楼

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