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标题: 精原干细胞建系后marker验证 [打印本页]

作者: 20111109 时间: 2013-7-19 13:07 标题: 精原干细胞建系后marker验证

本帖最后由 20111109 于 2013-7-19 13:11 编辑

[attach]53738[/attach][attach]53737[/attach]
如上图显示的，我验证了PLAF OCT4 stra8 C-kit SSEA1等
我想问的是
1、理论上，这些marker分别应该定位在哪里（核或质）
2、这些marker分别在什么情况下表达（即哪些是未分化SSC表达的，哪些是分化SSC表达的）
3、有没有关于SSEA1的文献，比较新的，我对SSEA1了解很少。& I3 f- X. B/ D
4、C-kit 的抗体哪个公司的比较好？有没有人做过的。
刚接的课题，刚建的细胞系，各种懵懂，先谢过各位了~~
) T0 J9 p( }+ p: Y! a
5 g$ M. o4 B7 {" Z* ? S# c9 O

作者: jialiyang 时间: 2013-7-19 13:53

回复 20111109 的帖子

1、对于你所选用的marker所在的部位你可以把你选用marker的说明说下载下来，里面会说明是膜蛋白还是核蛋白5 Z# T; b% z- c0 l! |
4、C-kit 也称CD117，我们实验室用的是Dako ,CODE A4502

作者: bj123 时间: 2013-7-19 14:09

回复 20111109 的帖子 G5 Z& P3 Z# L( [2 V, |

你染得ssea-1好奇怪啊。应该是一个膜表达的marker。

作者: 20111109 时间: 2013-7-19 14:54

回复 jialiyang 的帖子

抗体说明书里面做的荧光许多都是在非干细胞里面做的，不知道有没有参考价值。。。

作者: 20111109 时间: 2013-7-19 14:58

回复 bj123 的帖子& r' A) M ?" y+ k* u* ?
, L8 u6 ^) M; a% l, {
嗯 C-KIT也是一个膜表达的蛋白，我做的这个结果是在核的。所以我觉得也许是因为C-kit 和SSEA1的抗体不行，而且本来我做的这个验证预期结果也是C-kit和SSEA1不表达的

作者: moluxingke 时间: 2013-7-19 15:23

照片不能再照的大一点了吗？那样是核定位还是胞质或是膜定位也好看一些呀。

作者: 20111109 时间: 2013-7-19 16:42

[attach]53766[/attach][attach]53767[/attach][attach]53768[/attach][attach]53769[/attach][attach]53770[/attach]

作者: 20111109 时间: 2013-7-19 16:43

回复 moluxingke 的帖子4 Y9 h- Y) { l7 q. d
, C/ W# d5 ?! y/ K6 w$ ]: [) t
抱歉我把40X的图原图放上了~~

作者: zhangyan813 时间: 2013-7-19 16:58

首先我想问一下，你做的是什么物种的SSCs，大鼠、小鼠还是大动物？不同的物种现在已经有研究的很清楚的特异标记基因，建议用特异的基因做鉴定。6 @. w/ F4 Q1 l
其次，你的SSCs，通过形成clony的样子感觉还是蛮好的，长得很好。但是我建议你做染色的时候，不要做这么大细胞浓度的，这样的话，一大团是看不清楚，到底是在膜上还是在细胞核里。打算做染色的wells，最好是接种的时候少一些细胞进去，或者是生长了两三天的时候就固定来做，细胞浓度低一些，会好很多。
再次，PLZF, OCT4都是核定为的，这些都是要做通透才能够得到很好地结果的，你不知道在哪里定位，不知道染色是怎么做的，没有通透得到的结构是否可信？另外，c-kit建议你最好不要用来做鉴定，这个基因被认为是分化的标志，但是在SSC里也还是有表达的。

作者: 20111109 时间: 2013-7-19 17:08

回复 zhangyan813 的帖子

感谢您的答复~~" q6 X9 i7 P# ?0 ?1 R+ h( a! u
我做的是小鼠的SSCs，因为我是第一次建系，第一次做milicell，所以什么都不知道的情况下就做了，(⊙o⊙)…实验还是应该了解全面再做的。
您的建议很对，核定位要做个triton打孔。
但是，之所以染C-kit就是想判断培养的SSCs是否发生了分化。。。文献里说未分化的SSCs是不表达C-kit的，因此做了。

作者: yuanyan2010 时间: 2013-7-20 11:15

stra8表达吗？c-kit理论上也不表达的。你这是第几代的细胞。

作者: 20111109 时间: 2013-7-20 11:36

stra8 是表达的，C-KIT显示核上有荧光，但是荧光不是很强。可是C-kit不是应该在膜上么？第F5代

作者: 细胞海洋 时间: 2013-7-22 09:25

回复 moluxingke 的帖子, [ P7 n& B3 r: A# v7 e

点击图片可放大

作者: 490096812 时间: 2013-7-22 22:09

做个精原干细胞移植，看看能不能产生正常的精子

作者: w343989328 时间: 2013-7-22 22:43

先回答下你的问题：
1.PLZF、OCT4都是核定位，stra8编码的是视黄酸受体，胞膜胞质都有；KIT、SSEA1是膜蛋白。
2.从我所知的。小鼠的PLZF在AsAprAal中均有表达，有文章说OCT4和PLZF一直是共表达的。也有的报道OCT4是As和部分Apr，另外，OCT4的表达应该是比较弱的，那OCT4来做IF估计不能得到很漂亮的图，我看你上面的图也是曝光爆得很长。STRA8和SSEA1是生殖系细胞的marker。KIT从A1开始表达。另外，SSEA1是根据一个单克隆抗体找到的抗原。我至今不知道是什么基因编码的，看文献，也觉得是比较久远的文献才会用SSEA1来染SSC。# ^9 c" _: O5 \; ?% o4 f
3.SSEA1全称stage-specific mouse embryonic antigen 1，对这个抗原我也比较困惑，所以一直避而不见。

我还想请教几个问题，你这些细胞是在培养皿底做的还是？我自己也在染SSC，但是SSC有一个特性就是贴壁特别不牢，尤其是克隆长到像你的这么大的时候，做个IF之后就都不见了只剩下些小克隆。我想问问你是怎么解决的？还有就是，你的PLZF是没有透化过？方便把抗体信息透露一下吗？我的PLZF染得都不是很强。% g5 p+ u4 o& i4 ]- q5 d
0 k" g4 U+ a. f6 n" d
还有个建议，建议不要染KIT，因为IF这东西，阴性阳性本来就很模糊，需要对照。当然你可以去找3周大的小鼠睾丸消化成单细胞之后做阳性，但是太麻烦。而且，PLZF是转录抑制因子，它就结合在KIT上游的调控序列上。! c2 |; y5 Q4 |8 |* }

作者: 20111109 时间: 2013-7-23 13:55

回复 w343989328 的帖子1 W/ h9 }5 }; M1 V! ~& d' m/ F

1、贴壁不牢的问题：我底下还是种上MEF的。
2、PLAF下没有透化，RD AF2944

作者: w343989328 时间: 2013-7-23 14:16

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我也是用mef养，你是brinster的体系吗？

作者: 20111109 时间: 2013-7-23 14:19

回复 w343989328 的帖子1 V6 F& l! p6 J* N/ W
@9 j+ {8 M6 z3 x6 X+ l
no 是shinohara 的

作者: w343989328 时间: 2013-7-23 14:39

回复 20111109 的帖子

好的，谢谢了，我也觉得shinohara会比brinster的高级一些，青出于蓝胜于蓝嘛

作者: gemstone 时间: 2013-8-15 22:44

SSC在培养到2个月以后大约12代以后，oct4的表达会明显下调。不知道大家有没有这种体会啊？

作者: w343989328 时间: 2013-9-2 14:57

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我刚分离出来的thy+都没有OCT4。。。

作者: lfate 时间: 2013-9-17 08:23

回复 w343989328 的帖子

应该是有的，只是表达量比较低。
楼主的IF图最好有feeder细胞作为negative control

作者: tangruiling1973 时间: 2014-3-19 21:40

是新生的还是成年的？原代培养体系的血清浓度是多少？

作者: 20111109 时间: 2014-3-26 14:08

回复 tangruiling1973 的帖子& t9 r) @! }6 k. t

1%~~

作者: sunny218 时间: 2014-4-1 10:01

受教啦！！

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