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标题: 求助，脐带间充质干细胞培养中逐渐死亡 [打印本页]
作者: 听不到    时间: 2014-2-17 09:31     标题: 求助，脐带间充质干细胞培养中逐渐死亡

复苏脐带间充质干细胞后长了大概80%之后传代，0.05%胰酶（加了EDTA）消化，大概消化了15min，还是挺多细胞没下来的，后来是吹下来传代的。没有离心去除EDTA（师姐说不用去，因为EDTA量很少），直接传代。因为细胞量少，就多养了几天，传代后第三天看细胞长得挺好，都贴壁了，而且状态也挺好，就是漂浮着一些黑东西，不知道是什么，就直接用PBS洗了洗之后换液了。然后今天是第六天，看细胞的时候发现细胞都死了，大团飘起来的黑东西，只有极少数细胞贴壁生长，形状也变成了宽的，感觉特别奇怪。9 p  G# O' K7 e1 O1 u8 Y. a2 R
分析原因可能是没去除EDTA的原因？或者染菌？开始还怀疑过时消化时间太长，可是第三天的时候细胞长得挺好啊，愁死了！！求助！！！
作者: stefsue    时间: 2014-2-17 09:42

可以考虑下染菌的问题，拿培养液送检做个培养吧
作者: Amanda121201    时间: 2014-2-17 10:17

你放在高倍镜下观察 估计会看到可以动的小小的黑色的条状生物 我们管这个叫做黑胶虫 黑胶虫繁殖很奇怪 起初基本没有任何征兆 会突然间大量繁殖起来；还有一种状态就是 细胞状态很烂 没有明显的染菌状态 怀疑是支原体感染 你可以看一下
作者: 听不到    时间: 2014-2-17 10:46

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- q0 O9 c. a) q5 u4 C0 J' ^2 M+ V那么胰酶消化时间和EDTA去除与否在我这个情况中可以基本不予考虑是吗？主要考虑的就是染菌？
作者: Amanda121201    时间: 2014-2-17 10:57

干细胞对于胰酶的残留是很敏感的 过多的姨妹残留会影响其生长状态 建议一定要再重悬一下
作者: 孙帅帅    时间: 2014-2-17 11:15

1、你的消化时间真的很长，我不知道你们用的什么胰酶，但是我们一般37℃，消化1min，轻轻拍一下培养瓶，细胞基本上就都掉下来了。
5 N/ Q  v1 r' S7 y4 T1 `$ Y2、建议你还是缩短一下消化时间，不用把所有的细胞都消化下来，浪费点就浪费点吧，e酶会影响细胞状态。
- F" z& G+ r; d  ^4 U) ]3、你们不用含血清的培养基终止消化吗？3 {4 ^  r: G  f) V3 [
4、如果你养多了间充质，你就会发现间充质干细胞非常不喜欢e酶，但是如果你是做科研，就无所谓了。- `/ d* C" C* J. p
5、建议你还是重新做一根脐带，如果还是那样就要考虑所用的试剂是不是有问题。关于到底是不是黑胶虫或者支原体不好确定，也不必深究，把你的细胞养好了就行了！
作者: 月_幻影    时间: 2014-2-17 11:18

先检个菌吧，也不排除支原体感染。
作者: 一转身的距离    时间: 2014-2-17 11:30

被间充质细胞15min的消化时间吓到了！没有照片，不好判断是不是污染。
作者: lizzy_81    时间: 2014-2-17 12:17

胰酶消化，室温超过15分钟，对细胞都是有损伤的，不知道你的消化温度是多少。2 D0 H% ]0 D9 o" X: R) m

0 n9 V" a* N+ F! l2 ?. P" Z黑色的东西是显微镜下看到的吗？有时死细胞都成团了，也有点发黑。
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作者: menghy    时间: 2014-2-17 12:19

长满80%消化用15min，时间确实长了，需要考虑消化的影响，消化时间过长对后续传代有很大影响，几代后就可能衰老死亡了。
7 q, ^+ j3 |3 c! z& J6 H4 |这个应该是污染了，查一下支原体看看。
作者: deshenglll    时间: 2014-2-17 12:51

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应该不是染菌。要是污染的话会有明显的表象。再说了，就算污染细胞也会生长的很好的。下回最好上个图。
6 r% ~0 j$ _( E% w0 ?: s你的胰酶浓度是不是低了？还有消化时间挺长的。细胞吹打下来是会损伤的，漂浮的黑东西大多是细胞碎片。
作者: 听不到    时间: 2014-2-17 13:45

回复 孙帅帅 的帖子4 l6 M7 _5 V" d
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我也觉得消化时间特别长，听师姐她们说基本是37°C，5min就可以了，可是我细胞怎么也消化不下来，我再用力拍也只能下来特别少，我觉得是不是酶有问题...消化完是用含血清的培养基终止的。做科研为什么不用在意胰酶？
作者: 听不到    时间: 2014-2-17 13:49

回复 deshenglll 的帖子) b7 s1 p0 X$ [% @& a
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有图片，不过我不会上图...我也觉得不能是染菌啊，之前换液的时候细胞还长得挺好的，要染菌应该早染了才对啊。胰酶是0.05%的，之前我用过0.25%的，消化效果也不好，不知道为什么...
作者: 听不到    时间: 2014-2-17 13:54

作者: SKC-SFC    时间: 2014-2-17 15:11     标题: 123

本帖最后由 SKC-SFC 于 2014-2-17 15:12 编辑
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应该是胰酶消化的原因造成的。没有终止或者消化时间过长，都会造成细胞的老化或死亡。至于污染的问题可能性比较小。细菌污染的话，几天之内培养液会变浑浊，细胞也不会再生长。黑胶虫的污染：黑胶虫的形态很典型，而且是动态的，也好判断。
作者: 听不到    时间: 2014-2-17 15:28

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可是在传代之后细胞长得挺好，我再次换液后细胞才开始死亡的，如果是酶消化没去除的原因应该在传代之后里可能显示才对啊，你们一般是消化多长时间啊？还有胰酶浓度和EDTA的比例是如何？
作者: 孙帅帅    时间: 2014-2-17 16:27

回复 听不到 的帖子3 \  M4 ?# e: h* D5 V/ U

9 C! m! t6 _! [6 Q( H8 X- Y4 M. M我的意思不是那样的，如果培养基里有残余的e酶，细胞就长得很慢。如果做科研，用的细胞少，也可以不用离心去e酶。e酶消化之前要用生理盐水轻轻洗洗两遍残余的培养基！
作者: 细胞海洋    时间: 2014-2-18 10:03

回复 听不到 的帖子7 O; K9 u# h$ K5 m3 R
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回复 高级模式 附件上传 单个图片不要大于1000kb
作者: deshenglll    时间: 2014-2-18 11:43

回复 听不到 的帖子/ i9 ?, p5 P( t. T$ }; e9 e% R: y
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因为我们遇到过多次无菌检测阳性复苏的细胞污染了，细胞还是长得很好的。所以应该不是污染造成的。最好还还是把胰酶的浓度和消化时间再调整一下。
作者: 听不到    时间: 2014-2-18 15:43

本帖最后由 听不到 于 2014-2-18 15:44 编辑
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/ A. D3 @4 r: Q4 G  ~# z) v7 U2 d7 G9 e[attach]59190[/attach]
5 `( r  Q, X. t3 i! b细胞状态如图，感觉特别不好，可是如果是胰酶的原因，难道是在4度里放的时间太久了？
作者: 沙漠狐o0    时间: 2014-2-19 13:16

为什么不用0.25%胰酶？消化1~3分钟就可以...
作者: 听不到    时间: 2014-2-19 14:06

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恩，貌似确实是我的胰酶有问题，换用了师姐的0.25%的胰酶，1分多就消化下来了
作者: 倒腾细胞    时间: 2014-4-14 21:42

初来乍到 向前辈们学习
作者: 星空雾雨    时间: 2014-4-15 09:14

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终止消化是培养基和胰酶结合 还是里面的血清和胰酶结合 然后胰酶停止对细胞的作用
作者: weijunning    时间: 2014-4-15 09:53

回复 听不到 的帖子$ b$ f7 E8 I" @* R" U& z6 z# Q9 B
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消化不下来的细胞就不是间充质干细胞了。纯的间充质干细胞很好消化的，0.05%胰酶室温3min就可以完全消化。
作者: 听不到    时间: 2014-4-15 12:23

回复 星空雾雨 的帖子8 L- s6 T' p- B; Q1 D8 u( Y; O+ S
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是血清阻止了胰酶的作用，由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂（网上查的...不过是血清起终止作用这个是确定的）
作者: wuzhongqi    时间: 2014-4-16 14:59

你在倒掉培养液后，用生理盐水洗培养瓶没有？若是没洗的话，残留培养液会终止部分胰酶的消化，你就很难消化掉细胞。若是培养细胞中有胰酶，细胞很容易分化。
作者: 星空雾雨    时间: 2014-4-16 17:31

回复 听不到 的帖子2 \' Y% k) p2 B- h/ o' ^- N
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我们用的无血清培养基  加入血清代替品 终止消化的话直接加的基础培养基 这样效果会好吗？还有 你终止胰酶用的血清是哪个牌子的 需要稀释吗  然后每瓶加多少？
作者: 听不到    时间: 2014-4-17 14:04

回复 wuzhongqi 的帖子4 w. S: U3 g8 S& O3 P# {4 k& e0 C1 q

) g+ v( I! y' t, ~6 ^胰酶会导致细胞分化吗？为什么？
作者: 听不到    时间: 2014-4-17 14:09

回复 星空雾雨 的帖子2 j1 \. I: R/ \. p2 k
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基础培养基是含有血清代替品的培养基吗？我也不知道行不行，我用的都是直接加血清的培养基。终止胰酶的话我一般是加与胰酶等量的培养基（含10%血清），然后离心去除胰酶。如果胰酶不与EDTA混合的话，我甚至整过直接加培养基来终止进而吹打然后分瓶培养的，不过那样加的培养基就挺多了。不过看有人说胰酶对干细胞不好，尽量还是去除吧
作者: 王苍金    时间: 2015-12-26 16:44

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4 m! m- \0 d) |4 [你直接加基础培养基 消化吗，不加血清替代品的
作者: 游遍芳丛pine    时间: 2015-12-28 09:34

消化15min！？一般3-4min就可以下来了的啊
作者: firstaider    时间: 2016-2-3 15:44

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: P: E4 H6 Z7 C这个应该是污染了，查一下支原体看看



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