山中来信
[i=s] 本帖最后由 marrowstem 于 2009-11-14 10:51 编辑 [/i]近来有网友提供两篇的有关iPS研究的最新论文：一篇是发在J Cell Sci.上的 《Sox2 is dispensable for the reprogramming of melanocytes and melanoma cells into induced pluripotent stem cells.》，另一篇是发在nature biotechnology上的《实时细胞成像区分真正的iPS细胞和部分重编程的细胞》，可以说一针见血，直指我个人的观点，但细细读后还是感觉有话可说，另外也有网友把我个人对重编程发生细胞来源的质疑嫌疑于无关的他人身上，这一点让我觉得尤其不安，我可以以对伟大的干细胞的神圣热爱来打赌：此《对返老还童的一点个人思考》一文与别人没有任何的关系，虽然徐某某和刘某某都是我心目中的“大侠”级人物，但事实就是事实，个人与他们没有任何的“亲戚关系”。另外也要申明一下的是，题目所含山中两字的意义纯属位置名词的指示意义，而非彼山中，山中伸弥（Shinya Yamanaka）的山中。
其实我只是一个关注干细胞发展的旁观者，而非干细胞研究的参与者；也只是看了一些与干细胞有关的各种各类文章后，从而产生了一些个人的想法和不定成熟的观点。也许可以更低一个层次的是，这些观点和想法本人并没有为此做过任何的实验或相关的研究来求证过，所以就好象是一场空对空的空手道：只是引用了别人已提出的观点或已发表的实验结论而产生的疑问来质疑他的可靠性，而且质疑所参考的依据也同样是另外别人已提出的观点或已发表的实验结论，唯一有自己的一点东西是对干细胞机制的可能思考。对iPS细胞理论的个人质疑也同样基于这样一个逻辑，因此如果我说话的口气让iPS理论的推崇者和追随者感到不适，我在此对他们致以个人最崇高的敬意和加以歉意。
我希望以后的跟帖中，大家停止无谓的争论和不必要的指责，而只谈有关干细胞的科学问题。以下容许我谈几点个人对此两文的思考或遐想，希望网友不要片面的认为我是死不认错。
对于第一篇网友提供的paper《Sox2 is dispensable for the reprogramming of melanocytes and melanoma cells into induced pluripotent stem cells.》，因为没有看到全文，只看了帖子上的内容，对此只发表以下两点不成熟的个人意见：去年11月Sean J. Morrison在nature上的一篇《Efficient tumour formation by single human melanoma cells》的文章证明：取自从12位患者身上来的黑色素瘤细胞，发现有约四分之一的肿瘤瘤细胞可在小鼠身上形成肿瘤（原代单个细胞移植），从而把肿瘤干细胞理论推到了悬崖边上；另外记得以前曾看过的一篇paper说到，恶性黑色素瘤细胞被异体移植，进行囊胚注射后，发现可以进入小鼠三胚层，生下来的小鼠可以正常发育。因此我想恶性黑色素细胞很可能包含了干性（stemness）的特性在里面，而不能代表一般肿瘤细胞的共性。
对于第二篇网友提供的《Watching reprogramming in real time》paper，我大致看了一下全文，尤其关注被转录细胞Dh1细胞系的来源，发现研究人员用的是来自human ES cell line H1OGN（人胚胎来源的细胞系），并只通过CD13的转阴来判断；另外这么多被转染的细胞中（上百万个），最后被认为重编程成功而成为iPS细胞的只有一个细胞株（ very rare）。对此，我想多说几句（个人观点），也许由于干细胞在细胞系里所含比例极小（小于0.0001%），所以完全有个别细胞被漏过或不被注意的可能，而这个细胞很有可能就是所谓的内含干细胞；另外用细胞标志来判断细胞的分化水平应该要有谨慎的必要，这里面的“教训”很多，如原来认为CD34+可以用来标记HSC，CD113+可用来标记某些肿瘤干细胞，但后来的研究发现它们并不能完全起到这个作用，也并不代表事实，真正的HSC很可能是CD34-的。一些原认为有效的肿瘤标记也是这样，如胚胎相关抗原（如AFP，甲胎蛋白）是特定细胞在胚胎发育的特定阶段、即组织形成过程中的不成熟阶段表达的分化抗原。成熟体细胞不表达这些抗原，而一些组织在恶变后即可恢复这些蛋白的表达。许多年来，这种胚胎相关抗原的重启表达被认为与癌变发生相关，是细胞恶变后去分化的结果。但实际上，在许多未发生肝癌的肝硬化病人的血清中就有高水平的AFP表达，而肝癌病人的癌周非癌组织中也存在AFP的高表达，因此目前认为胚胎相关抗原的重启表达，实际上是组织内干细胞在发挥代偿性作用而部分分化时所表现出来的现象，而决非去分化发生的原因。其它癌胚抗原如（CEA）、前列腺特异抗原（PSA）等的表达也是同样的类似情况。 目前一般认为真正的干细胞分子标记还处于一种不能完全明确的状况，很多被认为具有明确意义的细胞标志事后被证明是“徒有虚名”的。
其实iPS细胞也并没有大家现在认为的是那么伟大的一个“科学突破”。几十年前，就有人发现，一些种类的肿瘤细胞被囊胚移植后可以进入三胚层，并可以进入生殖系，繁育的子代可以正常发育。另外搞细胞培养的人发现，有些细胞在多代培养后，被培养的细胞可允许有逆分化事件的发生，细胞变原始。所以自然而然的可以产生一个值得思考的问题：细胞系中有干细胞的存在吗？培养的细胞形态也许又是会迷惑人的，因为我们知道进行体外培养的细胞，无论是原代培养还是传代培养，一般不保持体内原有的细胞形态，而呈两种生长形态：成纤维样细胞和上皮样细胞，此外还有一些游走细胞，所以我觉得我们决不能认为生长方式呈纤维样细胞的而就认为他就是成纤维细胞来的，这种培养得到的细胞系就是成纤维细胞系。
也许有很多的研究情况，我们观察到的或得到的结果很可能只是表面现象的呈现，而非真正的背后事实及所含机制。1、如广泛存在的一种癌前病变：化生。化生是一种最常见的癌前病变，机体内许多组织都可发生，而一种错误的观点认为化生是由原部位的细胞直接转变为另一类在此部位原本不该出现的细胞，如结肠细胞出现在胃的腺上皮细胞中，称为肠化。其实这是一种错误的认识，实验证明化生是原部位的细胞死亡后，由基底层的幼稚细胞（来自干细胞）在修复补充过程中发生异分化而来，而决非原来部位的成熟功能细胞的直接转变。其实肿瘤发生也遵循这个道理，所以认为肿瘤来自干细胞的异常分化不是没有道理的推测。2、在从组织进行目的细胞分离时，应该考虑到这些组织中可能会有多少种类的细胞隐含其中，如分离任何一种的肿瘤组织时，应考虑到其中所含的细胞并不是只有一种只有肿瘤细胞，也含有非肿瘤细胞如各种间质细胞、各种炎症细胞，以及可以表现分化潜能的血管内皮细胞及造血细胞等等；3、虽然在理论上可以认为只要有细胞分裂，就有细胞突变发生的可能存在，但事实上基于细胞分裂的“革命”不是这么容易随随便便就可以发生的，因为机体对细胞分裂有一套非常严密的控制系统。我们知道细胞周期的运转是井然有序地进行的，此种次序是靠CDC基因、增殖相关基因以及检验点的严格监视和调控来保证的。其中CDC（cell division cycle）基因的有序表达，受到一系列控制点的调控和监视，亦称检验点（check point），检验点严格地监视着细胞分裂周期事件的发生发展是否严格按照程序进行，如DNA损伤未修复前不能进入S期，S期DNA合成未完成不能进入M期，如果M期纺锤体和染色体连接不良则不能进入分裂后期。如果没有这一套监视系统，便会产生断裂的染色体、异倍体和基因丢失，而造成细胞遗传学上的紊乱，不是导致细胞癌变，就是引导细胞走向死亡。如果机体允许随便产生的含有突变的细胞容易生存下来，那么作为细胞宿主的机体是无法存活多久的。4、从肿瘤发生的条件看，干细胞的确是癌变基因的理想萌生处和持久的载体，首先肿瘤发生在某个细胞上需要这个细胞具有不断分裂的能力，而且该细胞的基因突变不会因为组织更新而丢失，其次，发生基因突变的肿瘤细胞必须保持在体内，因此高度分化的组织特异性细胞不会是肿瘤发生的始作俑者，因为它们终究很快会走向死亡（被替代），而具有长久活力的干细胞则具备肿瘤发生真凶的角色作用，另外干细胞还具有一个最重要的特性：细胞的不对称分裂机制，此可积累突变，使突变产生的结果从量变走向质变。
所以有人认为，科学研究就像人与大自然在玩一场捉迷藏的游戏，有时我们自认为获得了某一项科学的“真谛”、成功发掘了大自然的一个迷，但其实真正的谜底却还可能隐藏在更深层次的背后，而等待着你进一步去揭开。
（个人观点，仅供有兴趣阅读网友的参考）
附文：
1、 Sox2 is dispensable for the reprogramming of melanocytes and melanoma cells into induced pluripotent stem cells.
Utikal J, Maherali N, Kulalert W, Hochedlinger K.
J Cell Sci. 2009 Oct 1;122(Pt 19):3502-10. Epub 2009 Sep 1.
Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been derived at low frequencies from different cell types through ectopic expression of the transcription factors Oct4 and Sox2, combined with either Klf4 and c-Myc or Lin28 and Nanog. In order to generate iPSCs more effectively, it will be crucial to identify somatic cells that are easily accessible and possibly require fewer factors for conversion into iPSCs. Here, we show that both human and mouse melanocytes give rise to iPSCs at higher efficiencies than fibroblasts. Moreover, we demonstrate that a mouse malignant melanoma cell line, which has previously been reprogrammed into embryonic stem cells by nuclear transfer, remains equally amenable to reprogramming into iPSCs by these transcription factors. In contrast to skin fibroblasts, melanocytes and melanoma cells did not require ectopic Sox2 expression for conversion into iPSCs. iPSC lines from melanocytic cells expressed pluripotency markers, formed teratomas and contributed to viable chimeric mice with germ line transmission. Our results identify skin melanocytes as an alternative source for deriving patient-specific iPSCs at increased efficiency and with fewer genetic elements. In addition, our results suggest that cancer cells remain susceptible to transcription factor-mediated reprogramming, which should facilitate the study of epigenetic changes in human cancer.
2、 nature biotechnology volume 27 number 11 november 2009 1033
实时细胞成像区分真正的iPS细胞和部分重编程的细胞
强制表达几个转录因子可以使体细胞重编程为诱导的多潜能干细胞（iPS cells）。通过对正在发生重编程的人成纤维细胞进行一系列的实时成像分析，我们鉴定出了几个独特的细胞集落类型，它们在形态上与ES细胞相似，但是在分子表型和分化潜能上与ES细胞又有所不同。通过对这些细胞的多潜能marker、OCT4和NANOG基因启动子甲基化状态、以及分化形成畸胎瘤进行分析，我们确定了这些细胞集落类型中只有一个是真正的iPS细胞，其余的都是重编程的中间体（即部分重编程的iPS细胞）。TRA-1-60、DNMT3B和REX1三个基因的原病毒沉默和表达可以被用于区分这些细胞是否处于已完全重编程的状态，而碱性磷酸酶、SSEA-4、GDF3和NANOG还不足以作为细胞已发生完全重编程的marker。我们的结果还表明，使用化学成分确定的培养基培养细胞有利于形成完全重编程的状态，而不会形成部分重编程的细胞集落。我们的结果确定了完全重编程状态的细胞marker，彰显出对iPS细胞进行准确定性和标准化这一需求的重要性。
Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem (iPS) cells by enforced expression of transcription factors. Using serial live imaging of human fibroblasts undergoing reprogramming, we identified distinct colony types that morphologically resemble embryonic stem (ES) cells yet differ in molecular phenotype and differentiation potential. By analyzing expression of pluripotency markers, methylation at the OCT4 and NANOG promoters and differentiation into teratomas, we determined that only one colony type represents true iPS cells, whereas the others represent reprogramming intermediates. Proviral silencing and expression of
TRA-1-60, DNMT3B and REX1 can be used to distinguish the fully reprogrammed state, whereas alkaline phosphatase, SSEA-4, GDF3, hTERT and NANOG are insufficient as markers. We also show that reprogramming using chemically defined medium favors formation of fully reprogrammed over
partially reprogrammed colonies. Our data define molecular markers of the fully reprogrammed state and highlight the need for rigorous characterization and standardization of putative iPS cells. [i=s] 本帖最后由 marrowstem 于 2010-4-7 21:13 编辑 [/i]
四个月了，奇怪的是为什么不见一封回信？
如果有谁了解他近况的，希望谈谈近四个月来Yamanaka又有什么大作发表，paper又发在了什么高级杂志上（review除外），谢谢！ [b]回复 [url=http://www.stemcell8.com/redirect.php?goto=findpost&pid=57411&ptid=15309]1#[/url] [i]marrowstem[/i] [/b]
过来学习一下，看完了感叹一下marrowstem版主知识面的广阔哈！ 不错不错~~下次有空多来学习学习
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