骨髓间充质干细胞在CD4＋CD25＋调节性T细胞减轻大鼠移植物抗宿主反应中的作用
作者：田莹 邓宇斌 黄奕俊 那晓东 李艳 叶美红作者单位：中山大学医学院病理生理学教研室，广州 510080；1中山大学医学院药理学教研室，广州 510080【摘要】 本研究探讨间充质干细胞（MSC）对GVHD的作用及其机制。建立大鼠同种异体骨髓移植模型，同时输入供者的T淋巴细胞诱导出移植物抗宿主反应，联合或不联合移植供体来源的MSC，观察受鼠的GVHD的发生情况;利用双荧光标记抗体标记受鼠脾脏和胸腺单个淋巴细胞，通过流式细胞术分析CD4＋CD25＋调节性T细胞亚群比例的变化，分析MSC的作用机制。结果显示：实验组的GVHD的发生程度减轻，存活率提高，而CD4/CD8比值在GVHD组出现不同程度的减少，CD4＋CD25＋调节性T细胞在实验组中的脾淋巴细胞和胸腺淋巴细胞的比例分别为31.55±7.58％、93.20±2.69％，在GVHD组中的比例分别为20.90±1.90％、57.17±6.79％，实验组中CD4 CD25 调节性T细胞比例比GVHD组中增多，具有显著性差异。结论：MSC能有效抑制HSC移植后致死性GVHD的发生，提高生存率，同时MSC可能通过作用于体内调节性T淋巴细胞而间接发挥了抑制GVHD的作用。
【关键词】骨髓间充质干细胞；造血干细胞移植；同种异体造血干细胞移植；移植物抗宿主病；CD4＋CD25＋调节性T细胞
Role of Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells in Reduction ofGraft-versus-Host Desease by EffectingCD4 CD25 Regulatory T Cells in Rats
TIAN Ying, DENG Yu-Bin, HUANG Yi-Jun, NA Xiao-Dong, LI Yan, YE Mei-Hong
Department of Pathophysiology, Zhongshan Medical College, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, China；1Department of Pharmacology, Zhongshan Medical College, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, China
AbstractThe study was purposedto investigate the effects and mechanism of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) on graft-versus-host desease (GVHD) after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). The model of GVHD in rat had been established by allo-HSCT with donor derived T cells. The occurence of GVHD in recipients was observed in conditionwith or without donor derived MSC co-transplantation. Effects of MSCs on GVHD were analyzed by model ratsurvival rate and pathology.Proportions of CD4 CD25 regulatory T cells were determinedby using label spleen lymphocytes and thymocytes with doublefluorescent-labeled antibodies andflow cytometry. The results showed that MSCs inhibited the lethal GVHD after HSC co-transplantation and increased the survival rate. The ratio of CD4/CD8deceased in GVHD group in different levels, ascompared with that in the experimental group. The proportion of CD4 CD25 regulatory T cells of spleen lymphocytes was 31.55±7.58％ and 20.90±1.90％ in experimental and GVHD groups, respectively. Similarly, the proportion of CD4 CD25 regulatory T cells of thymocytes was 93.20±2.69％ and 57.17±6.79％in experimental and the GVHD groups, respectively. Meanwhile the proportion of CD4 CD25 regulatory T cells was higher in experimental group than that in GVHD group. It is concluded that MSCsmay prevent the lethal GVHD after allo-HSC co-transplantation and raise the survival rate of model rats by acting on the CD4 CD25 regulatory T cells in vivo.
Key wordsbone marrow-derived mesenchymal stem cell; hematopoietic stem cell transplantation; allogeneic hematopoietic stem cell transplantation; graft-versus-host disease; CD4 CD25 regulatory T cell
移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）是异基因造血干细胞移植后最主要的并发症，因此抑制或减轻GVHD的发生则成为提高移植成功率的关键。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC） 具有支持造血、 自我更新和多向分化的潜能， 同时它不表达主要组织相容性复合体-Ⅱ （MHC-Ⅱ）类分子，低表达共刺激分子 B7（CD80、 CD86）， 因而被认为是一种低免疫原性细胞［1］。MSC与同种异体T淋巴细胞共培养不引起T细胞的增殖，同时还抑制混合淋巴细胞反应及丝裂原刺激的T细胞增殖［2-4］。MSC在体内具有免疫调节功能，对造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSC）移植后的GVHD的发生发展具有抑制作用，但机制尚不清楚。本实验利用本室前期已建立的大鼠GVHD模型［5］，研究MSC对HSC移植后GVHD的抑制作用，同时探讨其作用机制，为研究MSC减轻GVHD的作用机制及MSC的临床应用提供新的实验依据。
材料和方法
实验动物
Wistar大鼠，SPF级，150-180 g；Fischer344大鼠，清洁级，均由中山大学实验动物中心提供。
主要试剂
DMEM/F-12、RPMI 1640培养液购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季清公司；流式荧光标记抗体（抗大鼠FITC-CD4、FITC-CD8、PE-CD25抗体及同型对照）购自Biolegend公司。
仪器设备
CO2细胞培养箱为Thermo公司的Thermo Forma型3131系列；倒置光学相差显微镜购自Olympus公司；流式细胞仪为Beckman Coulter公司产品；60Co γ治疗机为CGRmev公司的ALCYON型40A系列。
骨髓间充质干细胞（MSC）的分离及体外培养
本实验根据细胞贴壁的特性分离纯化MSC。清洁级Fischer344大鼠（100 g以下），脱臼处死，无菌条件下取双侧股骨，冲出骨髓腔中的骨髓细胞，1 000g离心5分钟，用含10％胎牛血清的DMEM/F-12培养液悬浮，接种于25 cm2培养瓶中，37℃、5％ CO2条件下培养，48小时后首次换液，去除悬浮细胞，此时，大量的红细胞和其他非贴壁细胞均被清除，以后细胞每隔3天换液1次。待细胞长至80％融合时传代，0.25％胰酶-0.02％ EDTA于37℃消化2分钟，1∶2接种于25 cm2培养瓶中，在37℃、5％ CO2条件下继续培养。待细胞传至第4至6代（即P4-P6）时用于细胞移植。
脾淋巴细胞及骨髓细胞的分离 清洁级Fischer344大鼠（100-120 g），脱臼处死，无菌取脾，在200目不锈钢网上用注射器针心研磨脾脏组织成单细胞悬液，Tris-NH4Cl融解红细胞，用PBS洗1-2次，无血清RPMI1640培养液悬浮细胞，调整细胞密度为5107/ml；取双侧股骨，冲出骨髓腔中的骨髓细胞，Tris-NH4Cl融解红细胞，用PBS洗1-2次，无血清RPMI 1640培养液悬浮细胞，调整细胞密度为2107/ml。细胞悬液经台盼蓝活力测定细胞活力均大于98％。
同种异基因骨髓移植GVHD模型的建立和实验分组
GVHD模型的建立SPF级Wistar大鼠作为受体，移植前24小时内经60Co γ线全身照射（TBI），剂量为850 cGy；清洁级Fischer344大鼠作为供体；将供体脾淋巴细胞和骨髓细胞经尾静脉注射给Wistar大鼠，每个受体注射细胞数约为脾淋巴细胞2107个，骨髓细胞1107个。
实验分组GVHD组（组Ⅰ）：移植脾淋巴细胞＋骨髓细胞（n＝10）（即阳性对照组）；实验组（组Ⅱ）：共移植脾淋巴细胞＋骨髓细胞＋MSC2106个（n＝10）；空白对照组：注射等量的生理盐水(n＝10）。
GVHD大体观察及病理观察指标
大体观察按体重下降、姿势和体位、活动度、皮毛结构和皮肤完整性5个标准［6］，分别于移植后第7、14天进行评分，并记录生存状况，生存时间超过30天者视为长期存活，比较各组受鼠的生存率和GVHD的发生情况。
病理观察于移植后30天（部分受鼠为GVHD病发死亡时）分别取皮肤、小肠、肝脏，脾脏和股骨组织，4％中性甲醛固定，常规切片，苏木精－伊红染色，光学显微镜观察。
流式细胞术检测
在移植后的第14天，分别取组I和组II受鼠的脾脏和胸腺，在200目不锈钢网上用注射器针心研磨成单细胞悬液，Tris-NH4Cl融解红细胞，用PBS洗1-2次，取1106个细胞悬液加入流式荧光抗体，其中脾淋巴细胞悬液中分别加入抗大鼠流式抗体FITC-CD4、PE-CD25；FITC-CD8、PE-CD25及同型对照，胸腺细胞悬液中加入FITC-CD4、PE-CD25及同型对照，4℃避光孵育30分钟，PBS洗去荧光抗体，1％的多聚甲醛固定。应用流式细胞仪（Epics Altra）检测，并用Expo32 Analysis软件分析结果。
统计学处理
实验数据以X±SD表示，用SPSS 10.0软件进行统计学分析。
结果
移植后的GVHD发生情况及生存分析
空白对照组的10只受鼠均于照射后14天内死亡，生存率为0％，表明照射剂量为致死性的。GVHD组的10只受鼠于移植1周后开始出现GVHD症状，表现为体重进行性下降，皮毛松散无光泽，脱毛，腹泻，弓背，活动度减少等，只有2只动物存活超过30天，其余均于移植后20天内死亡，存活率为20％。实验组的10只受鼠发生GVHD的情况明显较GVHD组轻，比较GVHD组和实验组在移植后第7和14天的评分，具有显著性差异（P
移植后GVHD病理学分析
取各组受鼠器官做病理切片HE染色分析。未移植MSC的GVHD组的骨髓组织各系造血细胞均减少，被脂肪组织取代；脾脏组织的正常结构破坏，脾小体基本消失，仅见组织轮廓。移植MSC的实验组的骨髓组织中各系造血组织均明显增多；脾脏组织内可见到正常的脾小体。GVHD组的肝脏组织中央静脉周围肝细胞呈点状或斑片状坏死，汇管区有淋巴细胞浸润；小肠黏膜肠隐窝扩张，单个细胞变性坏死，黏膜表浅糜烂脱落，广泛淋巴细胞浸润；皮肤表皮层变薄，基底细胞空泡形成，真皮下层淋巴细胞浸润。实验组可见肝脏、小肠和皮肤组织的结构基本正常（图2）。
CD4＋、CD8＋和CD4＋CD25＋T细胞亚群分析
单个脾淋巴细胞和胸腺细胞的CD4、CD8、CD25表面抗原的表达用流式细胞仪分析。根据细胞的大小和密度将门设在淋巴细胞群，用FITC、PE双荧光染色检测CD4/CD8和CD4＋CD25＋细胞亚群的比例。脾淋巴细胞群分析结果显示，GVHD组的CD4/CD8细胞的比例减小，甚至出现倒置，平均为0.41±0.78，而实验组的CD4/CD8细胞的比例均正常，平均为1.41±0.38，具有显著性差异（P
讨论
许多实验研究均显示，造血干细胞与骨髓间充质干细胞共移植能够提高造血干细胞的植入率，提高受体的生存率［7］，双向调节受体的免疫功能，预防或减轻GVHD的发生。本实验在本室已建立的大鼠GVHD模型的基础上，进一步研究了供体来源的MSC在减轻受鼠GVHD、延长受鼠生存时间中的作用。大体及病理结果共同显示MSC与HSC共移植较单独移植HSC减轻了GVHD发生的程度，提高了受鼠的生存率，结果与文献报道相一致［8］。但到目前为止，MSC减轻GVHD作用的机制仍不十分明了，关于这一机制作用，人们提出了许多假说。本实验对MSC这一作用的机制进行了初步探讨。首先，本实验研究了CD4、CD8两群T细胞在体内的变化。正常机体CD4/CD8的比值为1.5-2，CD4/CD8的比值正常是维持机体免疫系统正常运转的前提。在本实验中MSC在移植受体内改变了受体的CD4/CD8的比值，GVHD组的CD4/CD8比值出现不同程度的减小，甚至倒置（比值
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基金项目：广东省科技计划项目，编号2005B50301012 哦............... 支持你一下下。。 一楼的位置好啊.. 有才的不在少数啊 先看看怎么样！ 不错不错,我喜欢看 我来看看！谢谢 这个贴不错！！！！！看了之后就要回复贴子，呵呵 原来是这样