芪丹通脉片联合骨髓间充质干细胞修复损伤内皮细胞半胱天冬酶和c-凋亡抑制因子的表达
作者：李静，王文，陈军，王宗仁作者单位：第四军医大学西京医院中医科，陕西 西安 710033；陕西中医学院针灸推拿系【摘要】 目的：研究中药复方芪丹通脉片（QDTMP）逆转内皮细胞损伤的机制，为中药治疗及干细胞修复血管疾病提供理论依据。方法：采用全骨髓贴壁法和酶消化法分别分离骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)和人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)，采用免疫荧光法对HUVEC的标志性抗原FⅧ进行鉴定。将HUVEC接种在Tanswell下室，用高同型半胱氨酸（HCY）诱导凋亡，24 h后将MSC接种在Tanswell上室,并分别加入0.15%、1.5%、15%QDTMT血清， 以流式细胞仪观察凋亡情况，透射电子显微镜观察HCY诱导HUVEC凋亡的形态学改变，采用Westenblot法检测半胱天冬蛋白酶（caspase）-3, 及其抑制蛋白c-凋亡抑制因子（IAP）-1, c-IAP-2的表达。结果：损伤（EC HCY）组的HUVEC细胞凋亡率较正常对照（EC）组显著增加（P
【关键词】通脉片；干细胞；内皮细胞
Expression of caspase-3 and its inhibitory protein of apoptosis umbilical vein endothelial cell intervened by QDTMP plus bone marrow mesenchymal stem cell/LI Jing，WANG Wen，CHEN Jun,WANG Zong-ren//
Author′s address：Department of Traditional Chinese Medicine, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian，Shanxi，710033,China
Abstract：Objective:To explore the mechanism of QDTMP repairing function of apoptotic human umbilical vein endothelial cells（HUVEC） induced by hyperhomocysteine(HCY).Methods:Using the whole marrow-adherence way to get thebone marrow mesenchymal stem cell(MSCs) and collagen-digest way to get the HUVEC.FⅧ factor was stained to identify HUVEC. HUVEC were inoculated into the lower chamber of Taswell and intervene by HCY,24 h later MSCs were inoculated into the upper chamber.The percentage of HUVEC' apoptosiswas investigated by flow cytometry;the conformation of apoptotic HUVEC was observed byelectricity microscope.The expression of caspase-3、c-IAP-1、c-IAP-2 of HUVECwas investigated by west-blotting.Results:The apoptotic percentages of HUVEC in damaged (EC HCY) group increased than that of normal control group(P
Key words：Pellet for promotion of blood circulation;Stem cell;Endotheliocyte
高同型半胱氨酸（HCY）血症与动脉粥样硬化（AS），血栓形成等多种心血管疾病密切相关［1］。HCY可能通过损伤内皮细胞和血小扳，破坏机体凝血和纤溶的平衡，影响血脂等多个方面，诱导多种血管病变的发生［2］。半胱天冬蛋白酶（Caspase）是细胞凋亡的主要参与成分，其中Caspase-3是几乎所有途径的下游蛋白。最近的研究发现又有好多新的蛋白参与Caspase诱导途径的调控，参与着抗凋亡和抑凋亡的作用，其中凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）担当了重要角色［3］。我们以往的实验证实复方QDTMT血清能联合干细胞显著降低由HCY诱导的内皮细胞的凋亡率，我们就其抗凋亡的机制做进一步探索。
1资料与方法
1.1主要材料和试剂
Tanswell培养板（Corning)，DMEM干粉培养基（Gibco），胎牛血清（杭州四季青），Ⅱ型胶原酶（Roche），兔抗人FⅧ因子多克隆抗体（武汉博士得公司），异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗兔IgG(武汉博士得)，兔抗人caspase-3单克隆抗体（Biovision）, 兔抗人c-凋亡抑制因子（IPI）-1单克隆抗体和兔抗人c-IPI-2单克隆抗体（Santa Gruz）,辣根过氧化物酶（HRPO）标记的鼠抗人IgG(武汉博士得公司)。
1.2HUVEC的培养和鉴定
无菌条件下取健康分娩产妇脐带约50㎝（西京医院妇产科提供），找到脐静脉，以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，血管钳夹住一端，从另一端注入2.5%Ⅱ型胶原酶后血管钳夹住另一端,消化30 min收集消化液,1 500r/min离心5 min,收集细胞，接种在25ml的多聚赖氨酸包被的培养瓶中，在10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中37℃、5%CO2孵箱培养。采用免疫组化法对细胞进行Ⅷ因子荧光染色。细胞爬片以PBS洗5min/3次，丙酮固定，0.5%曲拉通（Trtion）X-100作用10 min, PBS洗5min/3次, 加一抗,4℃过夜, PBS洗5min/3次，加二抗,37℃作用10 min,甘油封片。
1.3MSC的培养
采用全血贴壁法，无菌条件下取12天仔鼠的股骨和胫骨，PBS冲洗干净，用含10鸖的DMEM冲出骨髓，吹打成单细胞悬液，接种于100 ml培养瓶，以相同于上述条件培养。
1.4含QDTMP血清的制备
选用成年大鼠体重（250～300g）24只（第四军医大学实验动物中心），药物以QDTMP干粉32.4g/100ml生理盐水配成，按1ml/100g进行灌胃，每天2次灌胃，连续3 d。3 d后腹主动脉采血，抗凝、离心、取血清。将自制的含药血清用10%DMEM配制成浓度为0.15%、1.5%、15%、的培养基。MTT比色法检测含药血清对HUVEC和MSC的影响。
1.5共同培养模型的建立
将HUVEC细胞以2105cells/cm2接种于Transhwell下室，以10%胎牛血清DMEM培养，待细胞长至对数增长期，用不含血清的DMEM培养6 h，将HCY以1mmol/L加入下室培养24 h后，在Transhwell上室接种MSC，按照干预的不同分为： HUVEC正常对照组、 HUVEC HCY损伤对照组、 HUVEC HCY MSC修复对照组 HUVEC HCY MSC 0.15%含药物血清组、 HUVEC HCY MSC 1.5%含药物血清组、 HUVEC HCY MSC 15%含药物血清组。分别于24h后收集细胞做各项检测。
1.6流式细胞仪检测细胞凋亡
HUVEC细胞处理同上,将各组细胞收集(细胞记数3106),PBS洗1次,重悬于10鸖的DMEM中,加入Hoechst33342,37℃孵育10 min,1 000r/min离心5min,加入碘化丙啶（PI）染液,4℃避光染色15 min,上流式细胞仪分析。
1.7进行HUVEC的培养
于干预后的24 h，收集细胞，离心，PBS洗3遍，5min/次，以3％戊二醛-15％多聚甲醛、1％饿酸固定1小时，取出细胞团快，送电境室切片。在透射镜下观察摄片。
1.8Westenblot 检测caspase-3, c-IPI-1, c-IPI-2的表达
同上收集细胞加Lysis缓冲液100μl(0.1 M PMSF/1ml)冰浴30min，用细胞刮刮下，移入1.5ml BP管中，用1 ml注射器反复抽提5～6次，每次间隔冰浴10 min后，4℃，12 000 r/min离心10min，取上清，加入加样缓冲液25μl沸煮。以十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，15%脱脂奶粉封闭，加相应一抗室温1h，4℃过夜，TBS洗3次加二抗，TBS洗3次，暗室暴光，化学发光显影（ECL）底物发光显色。
1.9统计学处理
统计采用软件SPSS 13.0进行分析,数据用均数±标准差(x±s)表示,率的比较采用x2检验。
2结果
2.1HUVEC的鉴定
细胞于36h后可见大量贴壁，呈小圆梭形，2～3d达到80%融合，见图1。FITC标记的FⅧ因子染色呈阳性，见图2。
图1HUVEC传至二代，呈梭形（略）
图2FITC标记的FⅧ因子染色呈阳性（略）
2.2MSC的培养及含药物血清对HUVEC和MSC的影响
用全血贴壁法筛选的MSC在培养第二天就有贴壁细胞，呈散在分布，3 d就见有不少扁平型和梭型的细胞，传2～3代后呈均一的长梭型，漩涡样生长。MTT结果提示,含药血清对两种细胞的活性均没有明显影响。
2.3流式细胞仪检测细胞凋亡结果
见表1。1mmol/L 的HCY加入下室培养24 h后，明显诱导细胞凋亡（P0.05），含1.5％、15％ QDTMP血清组呈浓度依赖性降低细胞凋亡率。
2.4在凋亡早期，细胞核染色体发生边集，在细胞膜周边聚集成新月形；随之染色体发生固缩，显电子密度增强，核形不规则，核膜表面凹凸不平，核发生碎裂，出现有核碎片，细胞体积变小，胞浆浓缩，已经可以明显看出细胞内质网扩张、变形，线粒体肿胀，空泡增多，细胞核碎裂。见图3、4。
表1芪丹通脉片含药血清对高同型半胱氨酸（HCY）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡的影响（略）
注：MSC：骨髓间充质干细胞；QDTMP：芪丹通脉片。与正常对照组相比△△ P
图3染色体边缘集合，核型凹凸不平（略）
图4线粒体空泡、肿胀、破裂（略）
2.5Caspase-3, c-IPI-1和c-IPI-2的表达
损伤对照组的无活性的Caspase-3酶原表达信号很弱，而活化的Caspase-3酶原（17KD）表达增强，与之相比，各修复组的活化Caspase-3酶原（17KD）表达减弱，以15%QDTMP血清组最为明显（图5）。损伤对照组的c-IPI-1和c-IPI-2表达都很微弱，c-IPI-2几乎看不见条带，但各修复组c-IPI-1和c-IPI-2的表达增强，其中c-IPI-1的增强较明显，而各修复组中以15%QDTMP血清组最为明显。
图5半胱天冬蛋白酶（Caspase）-3,c-凋亡抑制因子（IAP）-1和C-IAP-2的表达（略）
1. HUVEC正常对照组；2.HUVEC HCY损伤对照组；3. HUVEC HCY MSC修复对照组；4.HUVEC HCY MSC 0.15%含药物血清组；5. HUVEC HCY MSC 1.5%含药物血清组；6. HUVEC HCY MSC 15%含药物血清组。
3讨论
芪丹通脉片（QDTMT）是根据中医异病同治及气血相关论研制而成，君药黄芪，臣药丹参，佐使桂枝组成。诸药合用有益气活血、活血化瘀、温经通脉之效。通过对QDTMT系统研究发现该方剂能减轻心肌梗死面积，降低学粘度，升高血清中血管内皮生长因子（VEGF）含量，在临床运用中取得了较好的疗效。
血中HCY的升高进而诱导内皮细胞的凋亡可能是多种血管疾病发生的独立的危险因素［4］。在以往的研究中我们发现QDTMP联合MSC作用于HCY诱导的HUVEC能降低凋亡率，增加细胞SOD活性，降低MDA含量。由于复方研究难以采取高效液相进行定量追踪，我们按以往的研究报道采用高剂量QDTMP灌胃获得血清［6］。在此实验中，我们借鉴Transwell培养板建立共同培养模型［7］，进一步探讨了这种联合修复的机制。
细胞有多种调亡途径，Caspase蛋白家族从细胞内外以至于内质网等多种途径参与了对调亡的调控［8］。在各种途径中Caspase-3是凋亡发生的中心环节，细胞色素C一旦释放，与细胞凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1）结合，进而启动Caspase-9，再启动Caspase-3，诱导细胞凋亡; 细胞外通过凋亡因子（Fas）途径，与死亡受体DD结合，使Caspase-8寡聚化，从而启动Caspase-3诱导细胞凋亡。通过Westenblot结果显示，在损伤对照组，有活性的Caspase-3明显增强，在17KD处形成明显的阴影带，而各修复组有明显的改善，其中以15%QDTMT血清组改善最为明显。IAP蛋白是唯一内源性Caspase效应酶抑制物，具有杆状病毒IAP BIR（Baculoviral IAP Repeat）结构域，BIR结构是抑制细胞凋亡的必须的功能区域［9］。目前明知8种IAP，包括XIAP，c-IAP-1,c-IAP-2和ML-IAP等等。在实验中我们观察了2个Caspase-3的抑制酶，发现各个修复组的c-IPI-1和c-IPI-2的表达增强，其中c-IPI-1的增强较明显，X-凋亡抑制因子（XIAP）在保护细胞的时候被分成2个片段，使细胞免受Fas诱导的细胞凋亡，但不如整段XIAP作用强［10］。复方QDTMT对内皮细胞的保护作用可能是因为延迟了XIAP的分解，使得其在整段保护的作用时间延长，从而明显提高了保护作用。
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