请教大家一个有关阻断信号通路的问题

ind6562

各位高人，我想用siRNA阻断我所培养细胞的wnt/β-catenin信号通路，有人能告诉我具体的步骤吗？
4 M' n8 M! V# i. c9 U4 v* i1 \我看的文献说是将能阻断β-catenin的siRNA先与转染液一起孵育形成转染复合物，然后将转染复合物加入到培养基中（请问大家这里是不是要用特殊的培养基，还有要不要加血清？），再用这个培养基处理细胞数个小时。请问是这样处理就行了吗，中间会不会还有其他步骤？还有一个极其重要的问题：这些过程是如何做到无菌操作的？
, R! T* Z  [( t: i- D7 A如果有做过类似实验的人，能告诉我一下具体的步骤吗？感激不尽！

461650833

可以构建shRNA干扰载体 直接转染啊

ind6562

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6 v7 U2 h# M$ l% {* P9 x  [" _) ~7 H- H( x! `- ~. E
不好意思，可以讲详细些吗？

monk125

这是求步骤的吗？ 看你写这个是用lipo2000脂质体做的瞬转吧？
" z. a  B+ z9 e* _( v你买lipo2000的时候会送你操作步骤的，这个你放心好了，上面很具体* u( y& L  b+ j3 h9 @
还有就是培养基的问题 转染所用的培养基是无血清的培养基 跟你你养该株细胞的培养基一样的 不过是无血清的 但是 实际上只是混合液是无血清的 你的细胞还是预留一部分完全培液的 + \" q/ x, d6 A
一般的步骤是/ _! I& C1 \7 P6 a
1 转染前换新培液
  X* n/ A6 d# L* W) n4 @3 L2 lipo2000与无血清培液混合静置5min 同时质粒或者siRNA与无血清培液混合静置5min
3 t9 u( C2 _2 J! \3 上述两种混合液一起混合 并静置20min$ {" S! ~% g5 Y# Q
4 转染细胞4-6h后换新培液
, b+ d8 _! ^5 i- }. R+ ?8 F: @- e! c+ `6 V& V
注意：做好control 对照试验 培液要先预热 细胞不要长太满，切提前一天铺板

ind6562

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# [& e" {) |1 N; M( i7 P& Q% @$ ?4 v2 R# G- @7 T$ ?1 G7 X9 d% V  ]
太感谢了！！

ind6562

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+ [4 ]! P* {1 S$ G' s$ N
9 x; a; G! t7 I4 n3 Q2 X2 w高人，不好意思，我想再请教您一个问题。好像做正式的转染实验前要做一个检测转染效率的实验（貌似是用荧光什么的来检测），但siRNA和lipo2000试剂盒里我没发现什么带荧光的东西（其实lipo2000说明书我已经看过，但里面很多内容我还不理解，惭愧~），是不是要另外买一个试剂来测转染效率呢，能麻烦您给我说明一下这是什么情况吗？

monk125

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7 D/ ]4 {1 s5 M$ L$ z4 I$ F: G8 [! _) W* i: U
siRNA 就没办法做转染效率检测了，像质粒形式的shRNA是可以做效率检测的，比如你control 组的空白质粒上有GFP荧光标记，你可以做几组不同的浓度梯度，然后流式或荧光显微镜 看你的GFP positive那群细胞的比例，在某范围内应该成线性的，你就知道大致效率了。

monk125

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' h) f! c2 P. s6 q4 ~
siRNA 的效率怎么测 我也不懂 只能你设好梯度后 收细胞测靶基因mRNA浓度的变化了，做个realtime 就知道了

86964109

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. m+ k- o9 A6 F) p' _/ {' O+ e! @7 w0 v) Z: r3 a1 ^
siRNA也可以加荧光标记的，另外，一般会设置一个荧光标记的阴性对照，侧面反映转染效率，siRNA干扰需要好多对照，详情参考这个帖子吧http://www.dxy.cn/bbs/thread/7151795#7151795