大鼠全骨髓培养法为何看不到细胞贴壁??培养液也不见混浊和变色

bimuyu

换一种方法：
/ K8 c' }) n8 S1 A建议使用全骨髓贴壁法，接种后放置5天不要观察。* B& E# |6 t6 l+ v8 X
再一个在离心的时候，尽量将离心力调低一些，将转数降为1000rpm/min以下。
# ^7 a$ M8 y4 a+ y* T0 W5 R& P晃动要下，在重悬浮的时候不要过度，适当用试管冲一两下就可以，力度要小一些。5 m" r/ Z: I/ ~
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等5天以后，看到可隆就成功了。0 l9 y9 w4 E+ o; \6 l
祝你成功！

bimuyu

answer:* E' @3 ]2 o' _6 ]
肉眼下看不到区别，但是，/ \. L! i' ~7 a0 {5 L1 U. A. J% V
作鉴定时，发现纯度不一样。Percoll的高

bimuyu

我是48小时后半量换液，换出的液体再养一瓶，细胞长的很快，其实我是作自体成体干细胞移植用的，大鼠的股骨还要再接上（啮齿动物的骨头一扎就断了），再缝合。做了10来只了，都长的可以，从一根股骨吸出的骨髓够养2个25cm2的瓶子，你不会是种的过稀或过密吧。

bimuyu

建议：1、最好不要用成年大鼠，100克就可以；2、低糖DMEM加胎牛血清；3、进口一次性培养瓶

bimuyu

我的细胞长得很好，现在的问题是传代时候细胞难消化，胰酶消化了5分钟，很多细胞还是呈多角形巴在培养瓶上，有的8分钟后才变圆消化下来。不知道怎么回事。胰酶应该没问题，因为同时消化的U251细胞2分钟就消化下来了

bimuyu

消化前有没有用PBS洗过，从理论上来说有血清时胰酶就会被中止掉。还有细胞消化时不需要完全悬浮，只需回缩后吹打后就会下来的。

bimuyu

我的经验是：1、用一月龄120g左右重的大鼠，太大太小都不合适；2、用一次性培养器皿；3、培养器皿经明胶处理过夜，可促使细胞贴壁；3、培养液：进口低糖型DMEM（GIBCO公司）+15%胎牛血清（杭州四季青）+双抗；4、种植密度很重要，可以对比一下；5、消化细胞时，2-3min足够，否则影响细胞恢复活力，没被消化的不要管它，可能是其他与MSCs贴壁能力不同的细胞，其实这同时也是在分离纯化MSCs。

bimuyu

我的细胞长得很好，现在的问题是传代时候细胞难消化，胰酶消化了5分钟，很多细胞还是呈多角形巴在培养瓶上，有的8分钟后才变圆消化下来。不知道怎么回事。胰酶应该没问题，因为同时消化的U251细胞2分钟就消化下来了
" s! c. U) O3 z/ @
9 j# S# Z: b  Y% v8 _回复：我的酶浓度为0。25% （400毫升加0。08克EDTA,1克胰蛋白酶)。消化时间依细胞贴壁时间而不同。初次一般2分钟足够。一星期的五分钟足够。先消化下来的形态往往不好。消化时可适当振动培养瓶，细胞会加速下来。可先加半吸管中和培养液，迅速吸除。再加一吸管，下来后加三吸管中和。第二天换液即可。用吸管冲击效果也较理想。

bimuyu

谢老兄，还真是忘记用PBS洗了，我说怎么0.25％胰酶＋0.02％EDTA的消化液消化不下来呢。现在ok了

bimuyu

理说，MSCs贴壁后是比较耐消化的，司徒镇强的细胞培养一书写明需要5分钟左右的，你2—3分钟就消化下来的是MSCs吗？不会是贴壁迟，消化易的杂细胞吧