人脐血间充质干细胞讨论区

slau

我养了两份脐血间充质干细胞了。总是很容易衰老，希望跟大家好好请教一下，实验总是不成功，日子好郁闷呀！

slau

先说肝素的用量，如果肝素过多，容易使白细胞凝集，自然在后续的工作中提取到的干细胞量会减少，所以要控制好肝素的用量。我一般把肝素的针剂（12500U/2ml）用生理盐水稀释成250U/ml，使用时按25U抗凝1ml血，即1ml配好的肝素抗凝10ml血液。所以如果取50ml脐带血（取脐血量一般为30~80ml），就只要放入5ml配好的肝素就行了。
$ H$ f% e" M( y6 V7 a) i对于脐血间充质干细胞而言，很多文献提到首次全换液在第7天进行，也有文献提示在第3~4天换液。就我个人的经验来说，在第3~4天换的效果要好些，因为那时贴壁的细胞已经稳定下来，而如果到第7天才换液，虽然有贴壁的细胞，但细胞的状态已经不好了。首次换液后每3天进行一次半量换液。直到细胞有80%融合时才可进行传代。（注意：80%融合是就克隆形成单位内部而言，并不是要等细胞贴满整个瓶底。因为有些瓶子可能在整个瓶底中只产生一个克隆。在这种情况下，可进行1：1的传代，最好就克隆的面积选择合适面积的培养板的孔进行传代。）

slau

真正意义上的细胞融合，是使两个不同物种的活细胞紧密接触在一起，并且使接触部位的细胞膜发生融化。这样的两个细胞最后合二为一，完全合并成一个细胞。但是在同类细胞培养中的“细胞融合”就我个人理解有点不同于此概念。4 J/ R) B% B; z
就间充质干细胞而言，它是成纤维型细胞，并不像上皮型细胞那样紧密相连呈单层膜样生长，而是呈单个的生长（细胞还是有一定的排列方式）。当培养系统中开始出现间充质干细胞克隆时，克隆内部细胞间的距离仍较大；随着细胞数目的增多，细胞密度增大，细胞间距离减少，最终细胞间会发生接触；再加上有些细胞处于分裂过程中，细胞核分离了而胞质还没发生分离，便产生了双核或多核的细胞。综合上述的细胞生长情况，把此称为“融合”，当有80%的细胞出现这种情况，就是有80%的细胞融合了。（这是我个人对培养中“细胞融合”的理解，因为在倒置显微镜下，这是较为主观的判断，有时要凭经验。）  N  }- L+ z1 Z
在保证原代培养时有足够大的细胞密度的前提下，培养瓶底可以出现多个细胞克隆，最后克隆内细胞数目增多，克隆面积扩大，与相邻的克隆相接，最终细胞铺满整个瓶底，发生80%融合后便可消化传代。但是如果原代接种的细胞密度不足，有时可能只出现一个克隆（多数情况下没有克隆，我养过只出现一个克隆的），当克隆内的细胞有80%融合便可传代，不用等这个克隆内的细胞铺满瓶底。

slau

非常谢谢hardtc战友！得到您的指教我想对我的实验是有极大的帮助的！, K1 k! I, t( i* t9 }* m! B
这种原代培养的脐血MSC好像很难消化啊！
$ h& G$ a) T  d请hardtc战友指教一下消化时间大概多少？消化不好该怎么办？非常谢谢！

slau

非常谢谢hardtc战友！我的实验终于有些进展了！可是细胞好像长的好慢啊！我的原代细胞已经有二十天了好像还不能传代还没有见到hardtc战友说的融合80％的克隆！是不是有什么问题？2 v1 D/ i7 ]: ^  I& `% }
呵呵！我一直在不停地问哈！望不吝赐教！

slau

不要心急，原代一般可以持续20～30天的，我也是养了30天才传的，这也是脐血间充质干细胞和别的细胞不大同的地方。传了第一代，如果细胞状态好的话，大概1周就可以再传了。加油！！

slau

非常谢谢hardtc战友！我的实验终于有些进展了！可是细胞好像长的好慢啊！我的原代细胞已经有二十天了好像还不能传代还没有见到hardtc战友说的融合80％的克隆！是不是有什么问题？4 m8 H9 o9 ?$ h& o' B/ w$ S
呵呵！我一直在不停地问哈！望不吝赐教！
9 |# v1 e7 T  u, y" p# _4 E) l, Q9 c你采了多少脐带血？你的梯度离心多长时间？离心速率多少？你干脆把你的操作过程大致说说，如果你的脐带血采集量大过50ml，而且是在产后8小时之内操作，应该可以获得很多干细胞，我下来给你把我们做的脐带血干细胞的图片发上来

slau

提个醒:刚刚培养成功的同志们 在大批量冻存细胞之前 一定要预实验一下, 摸索好冻存程序, 短时间内复苏一次看看效果.9 L- f* K7 D8 s' E
说一下我的体会:1,脐带血量50毫升以上;2,2-4小时内分离;3,离心转数2200以上,离心时间20分钟以上;4,单个核细胞层吸取时要完全,向分离液滴加血时要轻柔\慢;5,接种密度十的七次方以上;6,第一次换液长 7天左右;7,原代细胞由于贴壁时间长 第一次消化会不完全,所以第一次不要指望完全消化下来;8,获得率低,百分之三十的样子.9,培养基中血清因素比较重要(浓度,品质).今天只想到这些.

slau

请问一下战友们# Y& ?# `7 M# B# ~. h" h
你们分离MSC时脐带血用红细胞裂解液吗？' j9 l7 ]  d) c  Z1 g7 n, h
请用的战友介绍一下配方和用法
9 ]* W# }+ y: j" k( B' j( X; J# R先谢谢了！

slau

我采集的血应该每次至少50ml以上啊，离心2000转20分钟后吸取中间层细胞后再洗涤两次后开始培养，DMEM+20%FBS(GIBCO)+FGF(20NG/ML)不知道还需要什么条件请指教！谢谢% ^% E. h, M# v/ t- K% D- J
我最近消化了一批细胞至培养板中换了几次液开始细胞长的挺好，后来好像有很多细胞就老化死掉了可见很多凋亡小体，但活细胞还比较多不知道这样的细胞还能进行诱导分化吗？希望能早点看到你们的图片哦！谢谢