干细胞分化为胰岛样细胞的研究近况 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:24 |只看该作者 |正序浏览 |打印

作者：胡彦华作者单位：哈尔滨医科大学附属第二医院肝胆胰及腹腔镜外科，黑龙江哈尔滨 150086
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      【摘要】  糖尿病是严重危害人类健康的疾病之一。胰岛移植是治疗糖尿病有效的方法，但供体来源问题限制了它的广泛应用。寻找新的细胞来源成为当务之急。干细胞研究为此开辟了一条新的途径。本文综述了近年来干细胞诱导分化为胰岛样细胞的研究进展，并对存在问题作了分析。
      【关键词】干细胞胰岛样细胞糖尿病


糖尿病(diabetes mellitus，DM)是严重威胁人类健康的疾病之一。患者出现胰岛素抵抗或分泌减少造成糖代谢紊乱，并继发眼、肾、神经及心血管等脏器的损害。尽管由于胰岛素的应用，尤其是近年来在胰岛素剂型以及给药途径等方面均取得了巨大进展，但实践证明外源性胰岛素并不能像人体自身分泌胰岛素那样完美地控制血糖并恒定维持血糖正常。胰岛移植，替代功能丧失的胰岛——细胞替代疗法(即补充β细胞的功能)是治疗糖尿病的重要方法，是一种更接近生理方式的有效方法，可实现对血糖进行持续监测和精细调节。它较目前临床常用的胰岛素治疗具有一定的优势。2000 年加拿大的Edmonton研究组在同种胰岛移植中取得了可喜的成绩，他们应用移植更多的胰岛细胞和不含糖皮质激素的新型免疫抑制剂的方法,使连续7例患者获得了停用胰岛素并维持良好血糖超过1年的效果［1］，但供体来源严重不足，免疫排斥问题限制着这种疗法的应用。应用干细胞(包括胚胎干细胞和成体干细胞)诱导分化为胰岛样细胞可能是解决这些难题最有前途的一种方法：①一旦建立了可大量诱导分化得到胰岛细胞的细胞系,就可大规模生产可供移植的胰岛细胞，不仅1 型糖尿病患者有了有效的治疗方法,部分2 型糖尿病患者也可从中受益。②通过自体干细胞诱导分化得到的胰岛细胞，可避免同种异体移植带来的免疫排斥问题。因此，干细胞分化来的胰岛样细胞将是糖尿病细胞替代疗法的最佳种子细胞。

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干细胞(stem cell)是来自于胚胎或成体，具有在一定条件下无限制自我更新和增殖分化的能力，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，具有于合适的微环境里向多系分化的潜能，产生组成机体组织﹑器官已特化细胞的一类细胞［2］。按发生学来源分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和成体干细胞(adult stem cell，ASC)。/ W' }2 A5 d9 A( D. z7 v

1.1　胚胎干细胞　目前认为，ESC存在于胚胎发育早期阶段，主要来源于囊胚的内细胞团和受精卵发育至桑椹胚之前的早期胚胎细胞，最显著的特点是具有自我更新、分化为各种类型细胞的能力［3］。1981年、1998年英、美科学家先后建立鼠和人的ESC系［4－5］，为研究ESC奠定了基础。研究人员已经由ESC诱导分化出血液细胞、心肌细胞和神经细胞等［6］。鼠［8－10］和人［13－14］ESC向胰岛样细胞分化均已有成功的实验报道，现论述如下：
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1.1.1　鼠胚胎干细胞　在鼠ESC向胰岛样细胞分化的研究中，主要应用两种策略进行分化：第一种应用基因表达捕获的方法。这种方法，以前应用于心肌细胞的选择［7］。Soria等［8］构建含有人Insulin/βgeo基因和Pgk-Hygro（phosphoglycerate kinase-hygromycin resistant gene,磷酸甘油酸激酶-潮霉素抗性基因，用于分选转染细胞）基因的质粒，转染鼠ESC-R1，在含潮霉素的培养基上选出转染克隆，再使其形成拟胚体（embryoid bodies，EBs），逐步培养，获得细胞克隆IB/3x-99，在体外IB/3x-99表现其胰岛素分泌量随葡萄糖浓度的增高而增高，该细胞团簇移植于糖尿病鼠后，可纠正糖尿病鼠的高血糖；第二种应用复杂的多步分化法。Lumelsky等［9］以ESC向神经细胞分化的途径为基础，经过实验创立了五步序贯培养策略。研究中，待小鼠ESC诱导形成EBs，将其诱导分化为能表达巢蛋白(Nestin)的细胞，然后进一步扩增Nestin阳性细胞，最后诱导分化Nestin阳性细胞为胰岛样细胞团。葡萄糖刺激时胰岛样细胞团的胰岛素含量可增加40倍，但胰岛样细胞团的胰岛素分泌量仅为正常β细胞的1/50，而将此细胞团植入已制备好的鼠糖尿病模型的皮下，实验组(移植组)比对照组(未移植组)的鼠存活期明显延长。但是，移植后不能纠正糖尿病小鼠的高血糖，原因可能是由于胰岛样细胞团的胰岛素分泌量较低和移植的细胞数量不够。为了提高胰岛样细胞的含量及胰岛素的分泌量，Hori等［10］改进了多步分化法，在培养液中以磷酸肌醇激酶抑制剂LY294002代替N2培养基中的B27，结果证明胰岛细胞团的胰岛素分泌量为正常β细胞的1/10，有效地增加了胰岛素的分泌量，而且移植到大鼠体内的效果几乎和胰岛移植的效果相同，显著地改善了糖尿病大鼠的高血糖状态。

但是，Rajagopal等［11］不赞成上述方法所作出的推断。他们认为，上述方法在培养过程中，培养基中都加入了胰岛素，分化的胰岛样细胞胰岛素染色阳性，就很可能是因为ESC摄取了这些外源性的胰岛素，而使实验检测结果中胰岛素染色过高，而不是ESC真正分化为胰岛样细胞分泌来的胰岛素。也就是说，这几种方法假阳性的可能性很大。然而，Paek等［12］通过实验研究否定了这种假阳性的推测，证实从ESC分化来的释放胰岛素的细胞团簇（insulin-releasing cell clusters，IRCCs）分泌胰岛素的机制是鳌合作用和胰岛素从头合成过程共同作用的结果，而不是摄取了外源性的胰岛素。目前，胰岛样细胞胰岛素染色阳性，是胰岛样细胞分泌的；还是ESC吸收了培养液中的胰岛素形成的，仍然存有争议。改进分化细胞的鉴定方法，例如不单纯地对分化细胞的胰岛素进行免疫染色，而是在免疫染色的同时检测Ｃ肽的含量，这样将真正证明分化细胞是否分泌胰岛素，将使这一争议迎刃而解。

1.1.2　人胚胎干细胞　在人ESC的研究中，由于使用人ESC的合法性和伦理性争议较大，因此，目前开展的范围非常局限，实验方法也参考鼠的实验方法进行。Assady等［13］的实验证明，人ESC在体外悬浮培养自发分化形成的细胞中胰岛素分泌细胞占0.1％～0.5％。这虽远远不能满足糖尿病移植的需求，但证明了人ESC向胰岛样细胞分化的可能性；Segev等［14］则通过实验研究，提高了人ESC分化来的胰岛样细胞的生成率，其改变以往先提取nestin阳性单层细胞后扩增的思路，而是将人ESC直接放在N2，B27，碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)培养基中生长，之后撤出bFGF并降低培养基中葡萄糖的浓度，加入尼克酰胺，这样得到的胰岛样细胞数量及稳定性均有所提高。未来人ESC向胰岛样细胞分化机制的研究，将说明胰岛样细胞的本质，有可能解决人ESC的法律性和伦理性问题，为人ESC的临床应用增加了广阔的前景。
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1.2　成体干细胞　当前，人们把ASC定义为存在于成体的各种组织中，具有自我更新和向前分化为一种或多种成熟功能细胞的不成熟细胞。近年来的研究发现成体干细胞具有跨系统分化的特性，即“可塑性 (plasticity)”。在ASC分化为胰岛样细胞的研究中，现主要以胰腺干细胞和间充质干细胞为主，胰腺干细胞与其他ASC相比需要较短的生物学过程，易于分化［15］；间充质干细胞，横向分化能力强，目前应用于临床的可能性较大。以下仅对胰腺干细胞和间充质干细胞分化为胰岛样细胞的研究分别加以论述。

1.2.1　胰腺干细胞　胰腺干细胞的“身份”至今并不明确。人们还没有发现胰腺干细胞特异的表面标志，无法像分离造血干细胞那样轻而易举地分离出胰腺干细胞。因此，存在不同说法。Zulewski 等［16］认为人及大鼠胰腺中存在既不表达胰腺导管细胞标志CK-19(cytokemlin-19)，也不表达成熟胰岛细胞标志，但表达胰岛细胞早期分化标志胰十二指肠同源异型盒基因PDX-1(pancreatic and duodenal homeobox-1）的nestin阳性的胰岛前体细胞(nestin-positive islet-derived progenitor cells，NIPs)，这可能是胰腺干细胞。这种细胞在体外培养中，可以表达胰岛素、胰高血糖素，通过RT-PCR还可以检测到一些神经内分泌因子和胰腺外分泌物质的表达，这些细胞可以形成“产生胰岛素的胰岛样团簇”（insulin-producing islet-like clusters，ILCs），尤其是在胰高血糖素样肽-1(glucogen-like peptide-l，GLP-1)的刺激下，这种变化更加明显。但也有人认为胰腺干细胞是由胰管细胞分化而来的，Ramiya等［17］从尚未发病的非肥胖糖尿病 (nonobese diabetic，NOD)鼠的胰腺导管上皮细胞诱导分化得到“产生胰岛的干细胞” (islet-producing stem cells，IPSCs)或ILCs，体外培养了3年，这些团簇样细胞可以分泌小剂量的胰岛素及其他胰腺内分泌素，移植体内证明这些分化来的胰岛样细胞能降低NOD鼠的血糖；而Bonner等［18］在体外成功诱导人胰腺导管细胞分化为有组织结构的胰岛样细胞团（cultured human islet bubs，CHIB），在细胞团中检测到细胞发育因子CK-19阳性的导管细胞和胰岛素阳性的胰岛样细胞，用免疫组化的方法也证明了这些细胞含有胰岛样细胞及其他同源细胞群，并且胰岛素分泌量随葡萄糖浓度的增高而增加，但这些细胞能否在体内发挥作用目前尚无报道。由于胰腺干细胞的定义并不确定，其特异表面标志是胰腺干细胞的研究所在。' e! k3 E3 E/ E) B( [
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1.2.2　间充质干细胞　间充质干细胞（mesemchymal stem cells，MSCs）是具有多向分化潜能的成体干细胞。MSCs存在于全身结缔组织和器官间质中，主要来源于骨髓、脐血、外周血和脂肪组织，以骨髓组织中含量最为丰富。MSCs具有多向分化潜能，可以分化为中胚层细胞及组织如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、腱及肌肉，以及内胚层和表皮细胞如血管内皮细胞、神经细胞、肺细胞、肝细胞及胰岛样细胞；具有巨大的体外扩增潜能；易于分离培养，获取方便；不引起免疫排斥反应，具有免疫抑制效应等优势，这些优势是其他干细胞无法比拟的。因此，其可能成为未来用于分化为胰岛样细胞的首选干细胞。

在骨髓MSCs的研究中，李艳华等［19］从正常成人骨髓中分离MSCs，在含10%胎牛血清的α-MEM培养基中对其进行纯化和扩增，用表皮生长因子 (epidermal growth factor，EGF)、bFGF等诱导MSCs向NIPs分化，用高糖无血清培养基和β细胞调节素、尼克酰胺等诱导NIPs向胰岛样细胞分化。结果表明，MSCs经第一阶段的诱导后可分化成NIPs，继续诱导6 d后变圆的细胞逐渐增多，并聚集成团，双硫腙染色阳性，免疫组化实验证明经两阶段诱导后的细胞表达胰岛素、胰高血糖素及生长抑素等内分泌激素，放射免疫分析结果表明诱导的胰岛样细胞团可以分泌胰岛素，葡萄糖反应性较弱。从而证明成人骨髓MSCs在体外可以被诱导分化为胰岛样细胞团。近期，陆琰等［20］将人骨髓MSCs体外培养，传3代后用EGF、β-巯基乙醇和高糖培养基诱导MSCs向胰岛样细胞分化。结果未经诱导的MSCs在培养体系中呈贴壁生长，梭形，经诱导分化后，细胞逐渐变圆，并聚集成团，胰岛素免疫细胞化学表明细胞团内的细胞呈胰岛素染色强阳性反应，双硫腙染色阳性，成功地在体外定向诱导分化人骨髓MSCs为胰岛样细胞。但这些人骨髓MSCs分化的胰岛样细胞能否在体内发挥调节血糖的作用尚无报道。目前，人脐带血MSCs分化为胰岛样细胞未见成功的报道，Shuro 等［21］从人脐带血中提取去除T细胞的单个核细胞，注入出生48 h内NOD/SCID/β2mnull（nonobesediabetic/severe combined immunodeficient/β2-microglobullinnull）鼠的静脉，移植1～2个月后，胰岛素免疫荧光染色和人染色体探针的荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）分析显示：人脐带血来源的细胞在受体的胰腺组织内产生胰岛样细胞。由于人脐带血MSCs来源于单个核细胞［22］，这为人脐带血MSCs分化为胰岛样细胞点燃了希望。
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MSCs体外被定向分化为胰岛样细胞取得了一定成果，但用来鉴定MSCs的特异性表面标志；MSCs体外分离和扩增方法是富集还是纯化；间充质干细胞在体外扩增生长时能否避免混杂的其他干细胞；扩增培养所得的有许多表面标志的细胞是否仍然是MSCs；优化诱导条件、提高胰岛样细胞数量及分泌胰岛素能力等方面尚需进一步研究。& [7 x$ ?" r4 b; e

2　目前存在的问题
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近年来研究人员在干细胞诱导分化为胰岛样细胞方面的研究已取得一定的成果，但这方面的研究还处于开始阶段，还存在以下问题：

首先，干细胞分化来的胰岛样细胞，其数量及胰岛素分泌量少，不能达到临床移植要求。目前，研究人员虽然发现了许多干细胞可以分化为胰岛样细胞，如本文所提到的胚胎干细胞、胰腺干细胞及间充质干细胞等，均可以向胰岛样细胞分化，可是分化来的胰岛样细胞数目占分化前干细胞数目的比例很低，胰岛样细胞较正常的胰岛细胞胰岛素分泌量少，从而导致从干细胞“真正”分泌的胰岛素是极少的。原因是干细胞分化为胰岛样细胞的研究仍处于初级阶段，人们还没有真正了解干细胞分化为胰岛样细胞的机制以及如何对胰岛样细胞进行更好地分离、培养、提纯和鉴定。因此，未来将致力于探求干细胞的分化机制、优化干细胞诱导分化的条件、提高干细胞分化为胰岛样细胞的数量、增加胰岛样细胞的胰岛素分泌量等方面的研究，使干细胞能够稳定、专一地向着胰岛样细胞分化，并且使其能如生理状态下的β细胞一样根据血糖变化合理动态地分泌胰岛素，达到适应于临床的要求。1 T9 P/ |5 M% T3 E. ^9 T, D( K
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其次，胚胎干细胞和成体干细胞孰优孰劣，这是现在和将来必须面对的问题。如果未来动物实验成功，两者谁更适合应用于临床移植就将摆在我们面前。目前，两者在分化、移植方面都各有优劣。分化方面，胚胎干细胞具有在未分化状态下能够长期增殖培养、分化能力强及多向分化等优势，相比成体干细胞却不能在未分化状态下长期增殖培养，分化能力有限，而且近年来在成体干细胞的“可塑性”上出现新的观点，对其分化的多向性提出了质疑［23］；移植方面，胚胎干细胞应用时所遇到的伦理学问题一直是限制其发展的因素，而成体干细胞在这一方面却有优势。所以，目前还不能判断两者孰优孰劣，但不远的将来，可能随着基因技术的不断发展、进步及干细胞分化机制研究的成功，两者均可以成功地通过基因改造分化为胰岛样细胞，共同应用于糖尿病的干细胞移植。
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最后，胰岛样细胞移植后的免疫排斥问题尚未得到解决。1型糖尿病是自身免疫性疾病，患者自身免疫系统攻击其正常β细胞。由于这一原因，胰岛样细胞移植后，除了患者对移植物的免疫排斥外，患者自身免疫系统可能也会像攻击患者的正常β细胞一样，攻击移植的胰岛样细胞，造成移植治疗的失败。目前为了解决这一问题，除了应用微囊包被技术外，对干细胞进行适当的基因修饰以对抗免疫排斥也在研究中。* L& X' V5 R* K" W6 v' \

总之，目前干细胞分化为胰岛样细胞在技术、法规及伦理等各方面尚有众多问题亟待解决，实验研究与临床应用之间尚存在一定距离。但可以预见，干细胞无疑是治疗糖尿病的最佳种子细胞。深入了解胰腺的个体发生机制及干细胞定向分化为胰岛样细胞的分子调控机制，将会加快糖尿病细胞治疗的研究进展；进一步探索成体干细胞的可塑性，可回避胚胎干细胞的伦理学争论等困难。糖尿病是遗传因素和环境因素共同作用的结果，虽然其病因复杂，但随着基因工程及细胞工程技术的蓬勃发展，对干细胞的研究逐步深入，诱导干细胞向胰岛样细胞分化必将成功，人类最终会攻克糖尿病。- x" T: d0 t; M2 ]

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