转基因小鼠制备实验方法（protocol)

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转基因小鼠制备实验方法（protocol)! H. D8 Z$ V0 n; ?
   
8 n( r/ F5 A% g7 n1、 选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG（10 IU）。+ I: e& H4 K6 N  G) g
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2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG（0.8 IU），并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠（2月龄以上）作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
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  @4 ^6 c* V; }6 D. b" A- D3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。2 d+ c7 P0 o) V

# u- G8 A$ K4 ~: K3 k( {4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。' J+ |! T( O: b5 n0 M
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5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。. B( e: d: k" ~3 j+ \

* p$ N0 A2 s6 N2 O7 E$ ^7 G6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。5 }* o  u" W& M6 ?  D; h

* P9 _: m* C- Y. b7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。2 D& K6 A1 w5 s3 @, K1 z  q

+ N6 R, ~8 f+ Z2 D8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。% A+ M: {( a7 d5 j& X

: {7 D9 h" ?  A$ [9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。6 T( p. V: t2 y7 [* a, d/ H
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10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。/ P0 o9 r8 y- j
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(一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)
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aulenuyah

回复 天极拾贰星 的帖子
8 l( Y0 s% [" a3 M) h3 }# b- {- i9 F# k
我怎么感觉咱们好像没说一块儿去呀

天极拾贰星

aulenuyah 发表于 2011-5-25 23:25
7 |4 v9 N/ D! F! m5 a: H/ U- b难道楼主是怕小鼠先交配了吗？？不过觉得这一步好像是没有必要的，因为小鼠都是公母分笼养的，基本交配不上

' {: j, T& U5 H% ^4 ~5 O  q: a阴道口封闭是指的你要超排得老鼠不处在发情期 这样就不会有内源的激素干扰你的PMSG跟HCG了 不过一般超排都用4W的老鼠 效果会比较好

aulenuyah

4 }1 F4 |6 _1 K9 x- E2 ~2 u

' s- b, m& i1 F% y+ n难道楼主是怕小鼠先交配了吗？？不过觉得这一步好像是没有必要的，因为小鼠都是公母分笼养的，基本交配不上

chliu

回复 lizyue 的帖子' ?5 T# l" D8 l) L: @5 m
3 ~# z/ v, h+ }* L% x( p
我认为楼主说的不是plug的意思，如果已经有plug了，就不用超排卵之后再合笼了

lizyue

回复 xiangchou812 的帖子% X- x/ W2 ~; i& P+ L% Y5 t5 _

7 X/ d/ b  b/ S: c  o2 S同问。5 x- z& x4 T$ t1 A% @  w3 h! }

4 C" Z. z7 K  Q, i- G) D/ ^小鼠交配之后，雌性小鼠的阴道口是被栓封闭的（“plug”）。但是楼主所说的是不是这个意思？建议楼主把英文原文贴来哦：）

xiangchou812

请问楼主“阴道口封闭”是怎么回事？是选取小鼠的标准吗？