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作者：罗杨，刘 一，张科强作者单位：吉林大学第一医院脊柱外科，吉林 长春 130021 2 H/ V) |1 K' P
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' L2 [; P: d5 M" N9 N 【关键词】MAPK；信号传导；间充质干细胞；成骨细胞
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丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)属于丝/苏氨酸蛋白激酶，广泛存在于哺乳动物细胞的胞质中，参与调节细胞生长、发育、分裂、死亡以及细胞间的功能同步等一系列生命活动。MAPK由多种同功酶组成，具有两个显著特征：一是通过VIII区域苏氨酸、酪氨酸双位点磷酸化活化，二是由脯氨酸介导的Ser/Thr蛋白激酶，具有最小共同靶序列Ser/Thr-Pro［1-2］。目前，MAPK家族有五大类成员，分别为细胞外信号调节激酶(Extracellular-signal regulated protein kinase，ERK)1/2、c-Jun 氨基末端激酶(JNK )/应激激活蛋白激酶(Stress-activated protein kinase，SAPK)、p38 MAPK、ERK5/BMK1(big MAP kinase 1)和ERK3/4 等。现在研究得最广泛的是ERK1/2、JNK和p38 MAPK。ERK1/2对生长因子和细胞外的有丝分裂原信号发生反应，促进细胞增殖，阻止细胞死亡；p38 MAPK和JNK被称为压力激活激酶，可促进炎症的发展，特定条件下激活细胞的程序化死亡。多种细胞因子、生长因子可以通过相应受体或其他跨膜途径激活或抑制胞内的蛋白激酶，并通过相应因子介导，最终激活或抑制MAPK。MAPK被激活的过程是保守的三级酶促级联反应，MAPK激酶的激酶（MAPKKK）激活MAPK激酶（MAPKK），而MAPKK又激活MAPK。
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骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是中胚层发育的早期细胞,具有自我更新和多向分化能力,在体外培养或体内微环境条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞以及神经系统的细胞［3-4］，具有广泛的临床应用前景。MSCs存在于多种组织中，如骨髓、骨膜、胸腺、皮肤、脂肪、肌肉等，是目前组织工程中常用的种子细胞。
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. x7 R: w7 _7 W/ Q/ Q/ w3 F成骨细胞又称骨母细胞,常见于生长期的骨组织中,多聚集在新形成的骨质表面，对骨组织的生长发育、损伤修复、骨代谢平衡及骨量维持起关键作用。成骨细胞数目减少功能减弱将导致骨形成降低,进一步引起骨质疏松。成骨细胞由骨内膜和骨外膜深层以及骨髓的骨祖细胞分化而成。在膜内成骨和软骨内成骨中,MSCs分化为成骨细胞,同时，分泌胞外基质(ECM),随着ECM的钙化,成骨细胞被包埋在骨质中成为骨细胞。
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% [/ b) Z3 S5 o6 M3 q; l( Z3 A4 e1ERK通路
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$ g+ z8 w0 ]/ e0 O$ C7 oERK是MAPK家族中最早确认的成员，它被MEK1/2(MAPKK)激活，进而磷酸化许多不同的靶蛋白,包括胞浆蛋白(如cPLA2、Raf-1、PLCγ等)、膜蛋白(NGF受体等)及多种转录因子(如Elk1、c-myc等)，对细胞的增殖、分化等进行调节。国内廖清船等［5］在利用维生素c、β-磷酸甘油诱导MSCs向成骨细胞分化过程中发现，与溶剂对照组相比,在促成骨细胞分化剂作用下,骨髓间充质干细胞ERK通路提前5d激活。ERK通路阻断剂(PD98059)能明显减少3H-甲基胸腺嘧啶掺入率,但对ALP活性、钙沉积量没有抑制作用，表明ERK可能是参与MSCs的增殖调节。Suzuki等［6］的实验也发现,ERK途径对细胞的增殖起重要作用,对其分化作用不明显。然而Jaiswal等［7］发现，在诱导成人MSCs向成骨细胞分化时有ERK通路的激活,ERK阻断剂PD98059能剂量依赖性的阻断其向骨组织的分化,并且出现向脂肪组织分化的增强，因此，认为ERK在MSCs向成骨细胞分化的过程中具有重要作用。由于出现这种矛盾的结果，所以要最终确定ERK通路是起着增殖作用还是分化作用，或是两方面均起着一定作用，尚需要近一步的研究。
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2p38MAPK通路
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p38MAPK主要是介导生理性应激、内毒素、渗透性应激、紫外线等刺激［8］。目前已经确定了5个亚型，即p38α(SAPK2),p38β,p38β2,p38γ(SAPK3),和p38δ［9］，主要被上游蛋白激酶MEK3、MEK6激活。廖清船［5］的实验显示维生素c、β-磷酸甘油能引起p38MAPK途径的激活，而p38阻断剂SB203580能剂量依赖性地减弱ALP活性、减少钙沉积量,但对［3H］2甲基胸腺嘧啶掺入率不仅没有抑制作用,甚至1μmol/LSB203580能够增加［3H］-甲基胸腺嘧啶掺入率,表明p38MAPK对MSCs向成骨细胞特异性分化可能起着重要的调节作用。而他在最近的实验［10］中，应用植物雌激素金雀异黄酮诱导小鼠MSCs，能明显增加细胞内ALP活性和细胞外Ca沉积量,并同时引起p38MAPK通路的激活和ERK通路的抑制,而应用p38通路抑制剂后，诱导剂的诱导作用显著减弱。Hua Zhou等［11］以小鼠间充质干细胞为样本，诱导其向成骨细胞分化，分别加入ERK及p38 MAPK的抑制剂，也发现p38的抑制剂能明显减弱小鼠间充质干细胞向成骨细胞的分化，而ERK抑制剂却没有明显作用。以上表明，在MSCs向成骨细胞分化的过程中，p38 MAPK通路可能起着更为主要的作用。2 u- y1 W: ]/ F, s: V+ u) h. j
! C7 l3 D4 n& r# c3JNK通路
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@3 [# w2 t5 v0 q, _5 ^& SJNK最初被称为应激激活蛋白激酶(Stress-activated protein kinase，SAPK)，它由三种亚型构成，JNK1,JNK2,和JNK3。JNK1/2存在于全身各个系统，而JNK3只存在于大脑、心脏、睾丸等。其上游激酶主要是MKK4和MKK7。JNK对生长信号不敏感，但许多能激活p38的因素也能激活JNK，例如TNF,IL-1,渗透性应激、紫外线等［9］。目前认为，JNK通路对于机械刺激更为敏感。李定宇等［12］给予成骨细胞剪切应力的作用，发现剪切应力能够促进ERK、JNK、p38 MAPK的磷酸化，并进一步促使成骨相关基因COX-2、Egr-1、c-fos及骨桥蛋白大量表达。
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MAPK被激活后，从胞浆进入到胞核内，作用于不同的下游底物从而调控细胞的增殖、分化、凋亡等生理功能。在MSCs向成骨细胞分化的过程中，转录因子复合物AP1是主要的作用底物。# h" Q" _0 y; f1 N" K( r0 X
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AP1由Jun和Fos家族成员组成,属于bZIP类DNA结合蛋白。Jun与Fos可以形成同源或异聚二聚体,并可与其他的转录因子家族,如CREB/ATF,NFAT,ETS,NF-κB及细胞核激素受体结合。MAPK信号通路通过增加AP1的含量及直接刺激AP1的活性而影响其活性。c-jun可以被JNK蛋白激酶磷酸化活化;ATF2既可以被JNK又可被p38蛋白激酶磷酸化活化。AP1在骨形成和成骨细胞分化中的具有明确的作用［13］:激活的骨形成细胞,表达高水平的c-fos和c-jun mRNA。体外培养成骨细胞,c-fos、c-jun和junBmRNA在增殖期高表达,而Fra-1、Fra-2则在分化期提高,而且Fra-2和JunD构成的AP1复合物可以激发骨钙素(OCN)的表达。Jochum和Sabatakos分别证实超表达Fra-1或fosB的转基因鼠明显提高骨的形成和骨基质蛋白的表达［14-15］。成骨细胞c-fos和c-jun蛋白的表达和活性增加可使骨组织的代谢变得活跃，合成更多的胶原纤维，参与骨组织的形成和重建。因此，利用MAPK的介导作用，细胞外信号通过增加c-fos和c-jun的表达和活性来促使MSCs向成骨细胞分化。8 x& S; @0 D: W* V1 r
* P3 i. d% j$ w8 h) I+ ]/ dMAPK信号传导通路是一个复杂的网络系统，真菌中，并行的MAPK信号通路在细胞信号转导中并无相互作用，其每一条MAPK通路都是相对独立的，通常不与其他通路发生交联。但是，在哺乳类细胞中各的MAPK信号通路之间通过复杂的机制既可相互区别，又可相互调节，既有自身的独立性，相互间又有千丝万缕的联系。ERK、JNK、p38MAPK三条通路，或是在上游蛋白激酶，或是在下游作用底物处，总是有其通路的交汇［16］。Hotokezaka［17］等发现p38抑制剂引起p38磷酸化减少的同时伴随了ERK磷酸化的增加；而MEK抑制剂减少ERK的磷酸化同样也使p38的磷酸化程度增加。这种复杂的、多联系的网络系统是确保细胞反应精确性和准确性的关键，细胞对外界刺激的反应是综合了各个信号通路之间的激活或/和抑制效应而产生的。. \' c$ F1 D' }
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虽然现在MAPK信号传导途径的构成及调节方式基本清楚,而且可以确定它在MSCs向成骨细胞的增殖分化中有着重要的作用。在但是由于其复杂性,在不同的刺激因素作用下、不同的细胞中，各条信号途径的激活及具体的作用都不是完全相同，同一刺激因素对MAPK不同的通路可能会有不同的作用，例如，植物雌激素金雀异黄酮可激活p38MAPK通路,但同时抑制ERK通路［10］。而雌激素则对ERK和p38MAPK通路均有激活作用［18］。此外这些信号途径交叉性如何,特定胞外信号与成骨细胞标志物的对应关系怎样等均未阐明,这些问题尚需进一步研究证实。
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当前，MAPK信号传导通路逐渐成为各个学科研究的热点，而通过研究其在间充质干细胞向成骨细胞的分化中的作用,有助于从分子水平了解骨形成的时空变化规律,为今后从MAPK信号转导途径入手,研制促进骨修复和骨形成的新方法奠定理论基础。$ c5 @* Q f( l2 A$ c
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