探讨DC-CIK的培养

hyg5481655

前几天在论坛上发了两篇CIK培养不好的帖子，广大坛友提出了不少建议和意见，非常感谢。今天的结果出来了（x-vivo无血清，OKT3 50ng/ml，IL-300IU/ml，D8天混合）贴出来供大家评价，本人也有几点疑问想和大家探讨。
+ F5 F" {/ H$ `8 W" s; w0 b之前D14的结果：7 ?/ _# G! y0 M' a" R  w
  {( ]) }1 @4 E, f# ~' K+ O4 q
这次D14天结果：
+ U3 R# c9 a5 ~0 R2 a$ ^; |
% `3 c1 H2 ^3 N! _0 j
! i8 ~( I4 W6 }" b7 y3 M2 d! L两图是用了旧的OKT3（怀疑有问题）和新OKT3的结果，差别不大，所以不是OKT3的问题。
% h$ s3 B4 B3 s8 }2 ?0 o# IIL-2换了一批新的，所以怀疑是以前的IL-2有问题。, w7 L3 C2 q  e2 U
现有几个问题请教坛友：0 h( n5 F  c3 `5 D3 [! z0 F
1. 今天的流式结果可以看到我调高了FSC阈值，使碎片所占比例减少，相当于提高淋巴细胞群占所有events的比例，40%多，这个数据是否满足回输要求？: N0 s. ~2 |; J
2. 细胞的数目不多。80ml的外周血提PBMC的时候计数为2*10的8次方，最后收获的时候竟然只有1.8*10的8次方，也就是说14D里几乎没有增殖，明显还是有问题？IL-2的量是否太少？
) d+ \. ]3 H: O3. 我们是用培养瓶培养，由于经常补液，我看到操作人员用175T的瓶子里面的培养基都超过100多ml了，是否是因为液体过多影响了气体交换导致的不增殖了？培养瓶和培养袋的差别大吗？
3 d% D& a* y7 n; _8 W  R& s4. 无血清培养体系和加少量血清（2%、5%）会不会导致细胞数目质的区别？这种情况加2%的血清就会让细胞数目的增长有几十倍？

lzlmiranda

1，这个问题很难回答，从双阳性比例上来说30%不低了，但是另外的那部分细胞占比还是有些大。+ q( l; }1 s  c3 w7 U
2，80ml的外周血分离出2*10^8的PBMC这个没问题，但是14天里面CIK一点都不长有两种可能性，病人自己的血液有问题，细胞活力不够；或者你的培养方法有问题，经典的培养方法第一天加IFN-γ，24小时后加CD3（OKT3）、IL-2,、IL-1α，之后根据细胞生长速度，补含有IL-2的培养液。IL-2的浓度不是一个确定值，我了解的从300——2000的都有，根据你自己所使用的IL-2的品质来摸索。
+ h6 ?2 [& B8 K+ M9 V" m( V3，培养袋的好处一个是方便操作，一个是省空间，如果不考虑操作的问题，培养袋和培养瓶单位培养基产出的细胞数目上有差别，但不会有质的差别。据我了解，175的培养瓶加液到150-200ml 的情况都有，所以你细胞数量差距如此之大，不可能是因为培养瓶的问题。
5 H1 C7 ^& p8 Q' d4，我曾经试验过用在无血清培养基里添加5%的胎牛血清做对比，效果并没有显著差异。另外重申，我做的只是实验，并没有进入人体。动物血清不应该进入细胞培养体系中。

lyj-0017

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2 W" E4 l: n( H  q8 @( |. S3 B9 x7 m5 F+ ?
1、提高阈值对双阳细胞比例不会有太大影响，双阳比例能做到20%左右是行业的共识。
* {+ @5 i* r( v4 z( h2、IL-2浓度可以适当提高一些，500-1000U/ml较为合适，但你培养14天，细胞数量竟然比初始量还少，这点说不过去，你的双阳表型还挺好，不会是计数计算错了吧，数量级对了吗？+ Y2 f5 g: @; R: b- S3 M  V
3、细胞培养过程中是可以看出培养液颜色变化的，100ml的总体积不少了。
2 S0 S6 U7 S# O0 x; t4、加与不加血清肯定会对细胞数量有影响，但不会影响特别大。

yuanyecat

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% D1 }$ k# m8 o! _5 Q, x5 w
+ O* R/ J- }  x& v5 p1. 这个数据没有问题，一般CD3+CD56+所占比例超过30%，但是你还要看看CD4+CD25+的Treg比例是多少一般不要超过5%，细胞总体活率超过90%。2 |& Y. M6 j  K4 ?) R% u' ?
2. 我觉得没问题，重要的是DCCIK数目增加，你IL2的浓度是多少？( A( u+ E7 R* Z* G  j" g
3. 培养液不要超过培养瓶总体积的三分之一。& j& N( {  d8 w- @
4. 目前来说，加自体血清的效果，DC和CIK细胞数目增殖远比无血清培养体系的好。

hyg5481655

回复 lzlmiranda 的帖子1 }- ]2 J/ g8 Z& a. J1 d* q
, F  @6 G  A+ [2 U! v
谢谢您的回复，说一下自己的看法
6 Y1 U! M$ m7 S! j1 c, a) _1. 这份血样双阳率可以，但是我也觉得P1群外的碎片有些多，至于这些细胞碎片会不会引起病人不良反应我不是学医的不清楚。# S3 x: ~; P; D! {0 F& U
2. 补充一点血样是健康人的，活力不会太差，应该是培养体系的问题，方法是经典的，IL-2的浓度我们打算分组做做看效果。我们的细胞密度在2*10^6/ml，细胞密度会不会有点太大？
9 d! L& S9 n/ ?6 J% W/ h/ U3. 有人推荐液体的高度在1.2cm以下，培养瓶加多点液体应该也不会对细胞密度影响太大。8 O+ Q9 c* B( P( A, `, D3 A/ |0 r% M( N
4. 加点自体血清试试。

David_Chu

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6 i! v/ v0 c  R% \- E9 f; Q6 w! N1 O6 `. p+ u, E' f
请问老师，细胞成团，你们是如何计数的呢？是强行把它吹散，还是有其他更好的方法？前几天细胞成团很厉害，是否说明增殖很厉害呢？我觉得不能等同。细胞在第几天开始会自行分散开来呢？

hyg5481655

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, i+ ^* B) i( R9 c# C
& q4 Z3 `4 D" J, m5 O2 h1. P1群之外的那些细胞碎片的数目有点多，有50%多，不知道是否会影响病人状况。
; x4 B- a7 Q4 w, A3 j1 P9 j& K2. 这个数目很奇怪，之前的PBMC数的时候有部分红细胞，但是比例不会大，数量级应该没问题。
  W  W& R5 |$ Z  q6 [, C( i( j6 [/ ]5 c3. 我们看颜色一变黄就补液，到后面1天一补了。

hyg5481655

回复 yuanyecat 的帖子" t/ _5 [3 y8 h) w* V% U
' M; L. q5 S1 E
1. T细胞群外的那些细胞碎片对人体影响大么？Treg后面会检测。
  _# y" P5 x2 I* x! ?* ~2. IL-2 300IU/ml，不明原因导致细胞数增殖慢，而且D14的时候细胞团还有很多，有的很大，是否正常？

lyj-0017

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/ C4 q% q, i# U3 b3 d, i
& W  N: ?6 {* u, }0 i细胞成团要分情况而定的，有的细胞成团需要每天吹散，否则细胞容易死掉；有的成团的是细胞已经死掉了，吹都是吹不开的，并且团块会包裹活细胞，这样的细胞可能长不起来；还有些细胞团，其实无需吹散，如果不动细胞，过几天就自动长开了。你没拍图片，不知道你是哪种情况，所以不好界定。

lyj-0017

回复 hyg5481655 的帖子1 Q+ i- j* W/ O
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1、你那个图里面除了P1，左面那部分也还是活细胞，淋巴细胞表型检测，没见过阈值调得很高的，这样会把原本是活细胞的部分信号也切掉。如果检测发现碎片很多，有的病人会因此发生副作用。2 \5 L: a6 [2 T8 h/ D
2、要么就是计数PBMC时计错了，要不14天的时间不可能在表型不低的情况下，细胞数目反而减少。* K* p1 g! n0 Y% R/ d) {2 w! A" n
3、根据你的描述，如果到14天时，细胞团还是很大，这就不正常，可能是增殖有问题。