探讨DC-CIK的培养

hyg5481655

前几天在论坛上发了两篇CIK培养不好的帖子，广大坛友提出了不少建议和意见，非常感谢。今天的结果出来了（x-vivo无血清，OKT3 50ng/ml，IL-300IU/ml，D8天混合）贴出来供大家评价，本人也有几点疑问想和大家探讨。! _3 M1 i7 X$ H
之前D14的结果：% I% ?  j' T6 d) m4 }9 a/ g( x

( y) C  ]5 E7 N1 q" m3 I5 P这次D14天结果：6 k3 e' ~9 g( s5 A) C* q4 a
: [! R0 C9 u' S- `

/ f8 N, C6 P0 l$ r9 r/ Z1 q两图是用了旧的OKT3（怀疑有问题）和新OKT3的结果，差别不大，所以不是OKT3的问题。
& W  w0 o* s' sIL-2换了一批新的，所以怀疑是以前的IL-2有问题。% G8 g% \$ n' \- r' f* o
现有几个问题请教坛友：* h" _# h# y) x' C; p& o
1. 今天的流式结果可以看到我调高了FSC阈值，使碎片所占比例减少，相当于提高淋巴细胞群占所有events的比例，40%多，这个数据是否满足回输要求？8 `0 r0 \4 p" k& b* c( X
2. 细胞的数目不多。80ml的外周血提PBMC的时候计数为2*10的8次方，最后收获的时候竟然只有1.8*10的8次方，也就是说14D里几乎没有增殖，明显还是有问题？IL-2的量是否太少？9 n1 `; b% E+ e) @3 u  V, r2 {
3. 我们是用培养瓶培养，由于经常补液，我看到操作人员用175T的瓶子里面的培养基都超过100多ml了，是否是因为液体过多影响了气体交换导致的不增殖了？培养瓶和培养袋的差别大吗？8 u8 z  E$ l( M7 r; _. f
4. 无血清培养体系和加少量血清（2%、5%）会不会导致细胞数目质的区别？这种情况加2%的血清就会让细胞数目的增长有几十倍？

lzlmiranda

1，这个问题很难回答，从双阳性比例上来说30%不低了，但是另外的那部分细胞占比还是有些大。- T! _6 ^( p0 {" H6 L' o
2，80ml的外周血分离出2*10^8的PBMC这个没问题，但是14天里面CIK一点都不长有两种可能性，病人自己的血液有问题，细胞活力不够；或者你的培养方法有问题，经典的培养方法第一天加IFN-γ，24小时后加CD3（OKT3）、IL-2,、IL-1α，之后根据细胞生长速度，补含有IL-2的培养液。IL-2的浓度不是一个确定值，我了解的从300——2000的都有，根据你自己所使用的IL-2的品质来摸索。- M5 V9 p8 S- N/ x6 e  d
3，培养袋的好处一个是方便操作，一个是省空间，如果不考虑操作的问题，培养袋和培养瓶单位培养基产出的细胞数目上有差别，但不会有质的差别。据我了解，175的培养瓶加液到150-200ml 的情况都有，所以你细胞数量差距如此之大，不可能是因为培养瓶的问题。- A) C' z$ G: M; E( ?/ N) x
4，我曾经试验过用在无血清培养基里添加5%的胎牛血清做对比，效果并没有显著差异。另外重申，我做的只是实验，并没有进入人体。动物血清不应该进入细胞培养体系中。

lyj-0017

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5 V* l1 \4 i; B& |" M1 Q) b/ `8 P. g2 @- l$ F
1、提高阈值对双阳细胞比例不会有太大影响，双阳比例能做到20%左右是行业的共识。, }1 w2 J! l1 z
2、IL-2浓度可以适当提高一些，500-1000U/ml较为合适，但你培养14天，细胞数量竟然比初始量还少，这点说不过去，你的双阳表型还挺好，不会是计数计算错了吧，数量级对了吗？0 O, N& n+ e! `* b/ q; d
3、细胞培养过程中是可以看出培养液颜色变化的，100ml的总体积不少了。
8 s1 f" e0 D( u+ Q( m4、加与不加血清肯定会对细胞数量有影响，但不会影响特别大。

yuanyecat

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2 o4 @: `: X$ K- S4 V
# L; |  b7 G2 w( k1 _0 _1. 这个数据没有问题，一般CD3+CD56+所占比例超过30%，但是你还要看看CD4+CD25+的Treg比例是多少一般不要超过5%，细胞总体活率超过90%。  u0 E: g8 {+ U3 ]5 m
2. 我觉得没问题，重要的是DCCIK数目增加，你IL2的浓度是多少？
' Y* L* s1 O$ d3 F% W9 C3. 培养液不要超过培养瓶总体积的三分之一。& w  |7 G9 U* Z/ S; F5 X
4. 目前来说，加自体血清的效果，DC和CIK细胞数目增殖远比无血清培养体系的好。

hyg5481655

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1 V* |& w( E& B" N谢谢您的回复，说一下自己的看法" i' t; G/ F% A4 I, p. X5 l% |
1. 这份血样双阳率可以，但是我也觉得P1群外的碎片有些多，至于这些细胞碎片会不会引起病人不良反应我不是学医的不清楚。4 L5 Q5 J( @: r8 D% p
2. 补充一点血样是健康人的，活力不会太差，应该是培养体系的问题，方法是经典的，IL-2的浓度我们打算分组做做看效果。我们的细胞密度在2*10^6/ml，细胞密度会不会有点太大？
3 h$ [2 n+ X5 R8 A, h( B3. 有人推荐液体的高度在1.2cm以下，培养瓶加多点液体应该也不会对细胞密度影响太大。! L" {3 K9 D( b
4. 加点自体血清试试。

David_Chu

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) }& d+ T. ~( T0 _, j5 g& {! r, p: [# c' c0 V
请问老师，细胞成团，你们是如何计数的呢？是强行把它吹散，还是有其他更好的方法？前几天细胞成团很厉害，是否说明增殖很厉害呢？我觉得不能等同。细胞在第几天开始会自行分散开来呢？

hyg5481655

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3 [6 |  {6 J& {, T: G0 H# V$ g* R
1. P1群之外的那些细胞碎片的数目有点多，有50%多，不知道是否会影响病人状况。( M/ y4 B5 J  K. p& O0 X
2. 这个数目很奇怪，之前的PBMC数的时候有部分红细胞，但是比例不会大，数量级应该没问题。5 v$ k# }/ l( U
3. 我们看颜色一变黄就补液，到后面1天一补了。

hyg5481655

回复 yuanyecat 的帖子, Q9 u7 F+ H0 `% T1 k9 Q
( X1 Q- c9 |$ o  }+ t" Y
1. T细胞群外的那些细胞碎片对人体影响大么？Treg后面会检测。
) q5 s+ Q, R4 p3 Z6 e2. IL-2 300IU/ml，不明原因导致细胞数增殖慢，而且D14的时候细胞团还有很多，有的很大，是否正常？

lyj-0017

回复 David_Chu 的帖子% q+ u8 K. _  g8 V  \8 w; p
. i, J8 F& ^$ b( y- z2 Y
细胞成团要分情况而定的，有的细胞成团需要每天吹散，否则细胞容易死掉；有的成团的是细胞已经死掉了，吹都是吹不开的，并且团块会包裹活细胞，这样的细胞可能长不起来；还有些细胞团，其实无需吹散，如果不动细胞，过几天就自动长开了。你没拍图片，不知道你是哪种情况，所以不好界定。

lyj-0017

回复 hyg5481655 的帖子; A8 u' r8 z  d1 ?

3 `0 u+ b& \, @4 |- F1、你那个图里面除了P1，左面那部分也还是活细胞，淋巴细胞表型检测，没见过阈值调得很高的，这样会把原本是活细胞的部分信号也切掉。如果检测发现碎片很多，有的病人会因此发生副作用。
, R1 [$ u6 P# n5 p2 M1 r! p2、要么就是计数PBMC时计错了，要不14天的时间不可能在表型不低的情况下，细胞数目反而减少。
9 O( Y6 k# s4 ]. @: m3 y5 K3、根据你的描述，如果到14天时，细胞团还是很大，这就不正常，可能是增殖有问题。