【请教】外周血分单核细胞培养DCs的详细步骤

wagumaxida

6 W) w. ^3 @7 J; t
! ^7 W3 Z7 E: A0 T主要有几个问题亟待解决, g1 I& c5 \, E! T4 z: e, a; Q
1.外周血分淋巴细胞时，梯度离心去除血小板时，离心梯度是怎么设置的？
) \( i9 |( B7 s2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：2 y  D  z0 A" M
  A.贴壁时需要加血请吗？需要加细胞因子吗，需要的话加哪些，量是多少？! C/ B  Y1 d5 N4 i
  B.贴壁时间是多长时间，2h还是48h？* E7 T/ {% x2 j  ?6 ]8 T8 N
  C.贴壁时是在培养瓶中好还是在六孔板里好？- {$ o# u* J1 ^$ J8 P
  D.这一步还有什么要注意的吗？9 x6 H+ C. |* Q
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：$ W0 ^" b7 O1 g* y
  A.换液间隔怎样？半量换液还是什么其他方式？9 _( _: |$ v5 Q! N- H8 p
  B.换液时所用培养液中因子的量是多少？! f. {+ w' M" i! q7 B6 q  b+ v
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：" ~5 f1 U: B' K5 T% u
  A.在第几天开始诱导？
. n" A" \. M: c7 s- j$ F: `! d  B.用什么因子或者药物进行诱导，量是多少？3 Q# b' {' B. [
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4之类的吗？
. a- o/ R; r) |) N  D.诱导多长时间可以收获？# {# P/ r  x. ?  H' R4 }
P.S. 如果要用荧光腺病毒感染的话，在第几天哪个阶段感染会比较好？/ ]& e. J, c! _% ]3 P, P

' V% h- j3 y# k非常感谢！

zhenhuale

同样的疑问，培养的过程中一直存在

luoziwei

持续关注

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。
3 {" q) B: @* a2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
- Z0 H! A) H. a' K  m A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。2 s. `$ B, Y  s+ Z( {/ ?9 M4 c
B.贴壁时间是2.5h; w- z+ M+ k( a' C6 K1 p1 L
C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。
4 V2 n8 P" N5 P# l8 U, B9 r! E/ }0 J# h% h+ ~/ w, S
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
) [$ g5 d* Y% z7 t/ `; b8 W% C" x A.换液间隔一到两天，半量换液
( {6 b' f4 y4 @B.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4/ X) a0 j! |4 F6 u/ N
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步： : |3 {7 Y: ~) T2 J4 M
A.在第五天开始诱导: N2 N3 r& U6 l% b' }$ ], E( x
B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。: g; c2 Q: f5 L8 f. ?3 h0 Q
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。& {7 G5 E3 _8 H# f
  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。' {1 `# [5 T+ d
2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
- D' f' w8 w7 x4 \% @& f, q5 _0 o A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。
+ S5 _* p, W9 d7 A5 L6 {0 J" z B.贴壁时间是2.5h' D1 @: b- ~5 k6 m+ s. P
C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。
  s$ f, O; P6 n( K
& |+ W1 R' B& v7 f- h3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
# e4 J8 U, X" }8 f2 e) Y A.换液间隔一到两天，半量换液1 C# G: |. S  B3 c4 z+ ~# `1 P1 V
B.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4' _2 [) J( i" m) W2 D
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步： 1 U/ h' o) z& L' ?+ O! _8 h
A.在第五天开始诱导
, Z/ D6 [2 G6 R- J7 w B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。
' B4 @4 {7 L8 f7 h; J( p  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。
) [( F  O& ?( F. A) L1 B  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

wagumaxida

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16
( S; T& V0 f  m  M1 J1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

, Y2 c9 F& {' }: j* u* F8 a感谢 另外收获后的维持培养也需要加细胞因子吗？ 需要加什么

hwlightning

回复 大少爷 的帖子" b# c7 f( E( z$ c& i0 L# h; p
/ P! ?- o" s; y6 x" f9 R  w+ ?
请问下GM-CSF,IL-4和TNF-α国产的就行还是要进口的？能推荐下厂家吗？

vanessa

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16
4 t4 X: L+ v. n! u) v! y1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

6 O# I, B* {! E" D2 i! f2 s
第一步我们一般是根据淋巴细胞分离液说明书来进行操作的，一般国产和进口的Ficoll离心力会有所不一样。

hwlightning

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' [3 g0 o7 s1 W( x. H$ ^! I  m, b5 g& ]' h
活性单位U与质量单位ng怎么换算啊？

大少爷

活性单位U与质量单位ng好像没有换算关系，每种抗生素好像都不一样。。。