HMSCS成骨诱导紧急求助(附图)

kqyy

小弟诱导HMSCS(P2代)诱导前细胞有点分化(分化比较严重),诱导培养基是(α-MEM+10%FBS，hyclone,0.3mM维生素C,10nM地米,10mM的β-甘油磷酸钠)共诱导9天，第9天先在6孔板吸去诱导培养基，再用PBS加入孔板吸3遍，洗前泡5分钟。再用4%多聚甲醛固定10分钟，干燥。为了方便染色我将玻片固定在载玻片上（细胞面朝上，很定没错）。室温干燥30分钟（等待中性树胶干燥，但是好像也没干）。-20℃保存，第七天开始免疫组化染色（第7天才到抗体，一抗是中杉的兔抗人胎盘碱性磷酸酶多克隆抗体），我二步法用的二抗是（上海长岛的），三步法（二、三抗都是中杉的试剂盒9001），但是两次的结果全是阴性，一个阳性也没有。下面是我的诱导后取出时的细胞照片，请高手指导：
! U! U6 W% n2 X3 P
1 y6 k- h0 ?5 z4 S2 M! Z我个人分析失败的原因如下：- a# U5 S  w2 v' t! j! g3 K& m2 G: b
1：我养的HMSCS是真正的HMSCS吗？但是骨髓穿刺养出来的应该没有其他的成纤维状的细胞阿？即使是成纤维，文献报道诱导的条件下也是可以成骨诱导的，检测碱性磷酸酶也是阳性（组化检测）。
, b. C  Q5 E4 @1 m: U2：细胞状态不好的原因。我的细胞分化比较严重，并且是第二代，P0是就有点分化。9 B; |( r0 a+ v0 R
3：4%多聚甲醛固定10分钟。是不是固定的时间不够。时间太短，碱性磷酸酶是水溶性的，如果固定不够，是不是碱性磷酸酶蛋白在操作的过程中溶解到水里面去了。* P9 u- D- d  y4 x) |5 {5 Z6 T
4:组化试剂的问题，即使是特异性不好，也不会全阴阿，我分两次一共做了4个片子。
1 x7 a4 f8 ^2 t0 h- w7 v% U5:还有问题就是细胞染色后在普通光镜下根本很难看到胞膜，我苏木素染4分钟，核也好浅。不知道是细胞没固定好，还是重叠太厉害，还是中性树胶没干的原因。
" ^* ^2 j1 ]( F3 ?6：老师分析说这个细胞本来不表达碱性磷酸酶，你诱导也只可能是低表达，可是我怎么就一点棕黄色也没看到阿。, h+ D  F  N( `1 h& L7 z
7：同时我也准备好了，担心我的组化效果不好，我也同时诱导好了细胞准备用茜素红染色。请高手指导0.1%茜素红-tris-HCl怎么配阿，要0.22um过滤吗，过程有什么细节吗？# t9 Y- D1 ]; t
8：我是不是可以钙钴法也同时染一下，排除一下原因？

可怜的孩子

一、固定之后取出干燥，我们从来没这样做过，细胞面朝上进行封片，你是这样做的吗？也错了。还有为什么要-20度保存。
7 P" j2 I9 a& i! T- n$ T- [7 U二、抗人胎盘碱性磷酸酶多克隆抗体，有人这样做吗？我们实验室从来没有人做过ALP的免疫组化，BCIP/NBT定性染色，还有半定量都可以做的。BMSC不诱导也有ALP表达的。5 y/ y4 L4 y: g( J
三、茜素红用tris-HCl配，终浓度0.1%，调PH至8.3，细胞爬片染色不用过滤的。钙结节用茜素红染色足够了。

kqyy

请问"可怜的孩子 ":
5 z+ }: I9 N( u$ h4 @6 w4 N" ]首先对你的答案我非常感谢,但是我还是有几个问题不懂.7 Q, m9 w$ \8 @& r
1.固定之后取出干燥------我指的是细胞固定好了后,从孔板取出.因为我计划把诱导后的玻片固定在载玻片上，方便操作,因此要等玻片干燥,否则会很蒙,看不清,因此细胞面朝上,不干扰下游的操作.-20度保存是指组化操作前保存在-20度.我在网上学的.6 K+ x% ~3 T. w1 o  K5 u
2.ALP的免疫组化我在外文上是见过的.但是我没做出来.9 u" G$ U: X# q/ P' V8 c) o  D
3."茜素红用tris-HCl配，终浓度0.1%，调PH至8.3",tris-HCl配的浓度是多少,最后用HCl还是NAOH调PH，配好后怎么保存呢？8 C  v4 v, O5 r5 |
4.我诱导的细胞形态有什么问题吗？如果方便，请上传诱导前和后的形态比较好的图片，便于小弟参考。

lvmaoshiwo

回复 kqyy 的帖子2 S3 H: x0 T4 _- m
( r, W. t8 o1 X
茜素红根据配后的pH用盐酸或氢氧化钠标液调pH,配好后避光保存吧，尽量现用现配，或者短时间用完 不建议长时间存放！

hhxxattxs123

" s7 }+ P! ]/ L: f: v7 k

$ B5 K3 l+ l: x7 b+ E5 ~回复 kqyy 的帖子
$ I! K6 ?( q9 f. S+ c; v4 Y- S; G' X3 r2 f) i# \' C
0.1%茜素红-tris-HCl配制方法：
" A& a! ^0 [8 \9 P- \& V! t1.tris-hcl 浓度有多种，有1mol/L，0.05mol/L还有0.1mol/L，在配制的时候，浓度使用可以根据自己的实验要求，1mol/L 的配制方法是 称取121.1g tris 即1mol 加入到900ml蒸馏水中，用HCL 将PH调至7.2-7.6定容至1000ml，本实验室用1mol/L的-tris-HCl，效果不错，推荐使用.
1 @* v  k/ d# s9 U* M2.取1g茜素红加入到100ml tris-hcl 中溶解，过滤后就可以使用。
( j% [/ i  w; q3.最好在2周内使用，时间长了效果不好。

illidancui

alp貌似免疫组化的文章很少见吧。直接用试剂盒做半定量很明显的，又方便。大多文章不都是一个alp染色加个茜素红染色，然后再加几个特征基因就ok了嘛。

yaolei1984

就我的经验看MSC成骨的诱导液' Z: [( D2 G; \2 U0 @) ~
对fb效果很差