脐带间充质干细胞遇到的培养问题分析及解答

袁小懒

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一、之前用组织块贴壁法，DMEN+10%CCS（配方不祥）培养间充干，一般13天弃组织块，16天即可达到要求数量，即使达不到数量，用DMEN+5%CCS传代一次三天后即可。( H/ n, A2 }7 K8 I, d4 n
二、现改用DMEN+10%FBS培养，发现细胞生长缓慢，克隆数变少，有些要到16天以后弃组织块，看着细胞克隆大小跟融合度差不多后消化收集，发现细胞数总达不到要求，且出现难消化的现象，用DMEN+5%FBS传代培养，发现生长非常缓慢有时三天后融合度还不到40%，细胞明显比之前培养的大，经常要传多代后才能收集到要求数量的细胞。问：7 t3 V6 S" s  n) [+ d
1、出现以上细胞生长变慢，克隆变少，细胞变大，难于消化的可能原因有哪些？如何解决？
. {, z4 R! U/ B# X5 j% Y0 q2、大家在培养过程中，培养传代细胞时血清浓度是否会比原代培养时降低，降为多少？（因为听说降低血清浓度可以延缓细胞衰老分化）' W. }$ P; E$ w- e
3、大家用FBS培养时还会加入什么试剂，加入量一般是多少？
4 F. [# S  R" _  ]) B4、CCS据说是某无动物源血清，大家分析一下其组成成分! L* z6 a3 u. C* N+ w1 p$ v3 ]
5、CCS原本含谷氨酰胺，另加谷氨酰胺对细胞生长是否有明显不同，另加对细胞衰老、分化是不是会有影响？: }3 U; Z$ h" R4 Q9 e# p  i  x
6、各位在培养过程中还遇到过什么问题？如何解决
1 P1 z; \6 L8 i$ b自己总结的以上现象的可能原因为：
- y" U: G: |; r: _1、CCS较FBS营养成分更加充分，更适于细胞生长，可能加入有某些生长因子，谷氨酰胺等- a/ b& p' ]# S1 e$ B* r' ]& c0 \, o
2、FBS原代培养时虽然看着细胞克隆数目及融合度达到要求，但应该是细胞比CCS培养的大，故收集到的数量不够，同时没有完全消化下来的原因也有
  E( u# B# O# i4 P3、传代培养时细胞大小明显变大，生长缓慢，可能是5%FBS难于满足细胞分裂生长，细胞逐渐变大老化，甚至分化。现考虑适当提高FBS浓度进行培养，加入谷氨酰胺
' c0 a6 |4 x7 {. ~) o3 t- X4 Z4、其他试剂的原因，最近换了一批DMEN，而且马上到期了，但发生问题的时间上有一定错位

deelon

我们实验室有培养UC-MSC和BM-MSC，培养基配方是：DEME+10%FBS+1%谷氨酰胺+0.25%bFGF+0.1%双抗。培养的细胞状态挺好的。不过我们用的是四季青的血清，培养代数多了细胞形态就不太好。

袁小懒

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; h. t/ [8 j/ N: |多谢分享

henryjia

楼主的CC是是什么？
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8 T; K) R6 @/ k$ K原代培养时用15%FBS 培养温度提高0.5℃ 细胞容易长出 传代后 改用10%FBS 温度正常 有利于细胞生长 保持其干性

CELL007

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你好，谷氨酰胺用什么溶解的？我怎么每次溶，都不是那么彻底？

weijunning

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谷氨酰胺不好溶解，我们买的gibco的成品，每次都是放4℃过夜溶解，第二天用的时候再放37℃水浴溶解，才能彻底溶解掉。

deshenglll

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培养基的问题。我们用于治疗的细胞一般3-5天出细胞，12天左右能冻存。中途换2次液。还是找一家好的培养基吧。细胞少了，细胞间的距离大对细胞生长是不好的。细胞的外形自然就会变大和分叉老化。所以传代的时候要按合适的比例传代。你可以加一些FGF等。