关于小鼠胰腺冰冻切片的免疫荧光染色

yaolinzhang

大家好！最近一直在做胰腺的免疫荧光。步骤如下：
) {6 G, W: x$ H4%的多聚甲醛4℃固定30min(4℃)，PBS洗三遍（5min/次）；0.3% tritonx-100处理20min，PBS洗三遍（5min/次）；二抗来源的血清（10%）封闭30min，加一抗4℃过夜，PBS洗三遍（5min/次）；加二抗37℃，1h，DAPI封片镜检。一抗浓度：insulin：1/50;Ki67:1/100。二抗浓度：Alexa fluor 488：1/100;cy3:1/200。结果Ki67阳性，insulin阴性。固定方法也试过甲醇固定，结果一样。请问，有做过insulin染色的吗？还有什么建议吗？注：一抗二抗体外实验已验证没有问题。- G* o, }% B5 E

ljs

根据楼主操作过程，应该是荧光双染。1.楼主你没有对照的结果啊。没有对照，样品检测结果无意义。2.根据你的情况，是否加单染的对照？3.双染荧光是否有一抗直接显色的方法？你的方法是石切的方法。冰切试试直接显色。

yaolinzhang

回复 ljs 的帖子3 c4 X0 O4 F8 M5 U' _+ w) w
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对，是双染。对照有，单染也是insulin阴性，ki67阳性。我的抗体是二抗带荧光的，没有订一抗带荧光的抗体。谢谢！