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本帖最后由 细胞海洋 于 2014-3-10 08:54 编辑 4 |& n7 ^& H5 d i& y. W+ h# v
- P3 a7 R a6 n2 r南大黄行许解决CRISPR的脱靶问题
9 L& @% a" J: `1 Z, A( a8 d+ x0 \$ }2014-03-06 1 来源:南京大学模式动物研究所 作者:潘德京
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南京大学模式动物研究所黄行许课题组和英国Sanger研究所 Bill Skarnes 课题组开展国际合作,利用Cas9切口酶和成对sgRNA,能够高效突变小鼠基因,并且大大降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应,《自然-方法》(Nature Methods)于3月2日在线发表了这一研究成果。 s2 ? z* }8 }- J- Z
以《应用CRISPR-Cas9切口酶进行最小脱靶剂量的基因组改造》(Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects)为题的论文第一作者为南京大学沈彬、Sanger研究所张文胜博士和南京大学张军,Sanger研究所Bill Skarnes教授和南京大学黄行许教授是该论文的通讯作者。这是黄行许课题组继上个月在《Cell》上发表文章后再次在高影响力杂志上发表他们的研究成果。: t- a0 X& f; B
CRISPR/Cas9系统虽然能够高效突变基因,但其脱靶效应妨碍进一步应用,特别是临床应用。为降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应,研究小组通过改进CRISPR/Cas9系统,利用Cas9切口酶和成对sgRNA(图1),通过注射小鼠受精卵,在不降低基因突变效率的前提下,可有效降低CRISPR/Cas9系统的在小鼠基因组上的脱靶效应。成对sgRNA的选择比较关键,两条sgRNA结合不同的DNA链,其PAM序列要以尾对尾(tail to tail)出现,并且两个sgRNA结合的位点不能相隔太远,Cas9切口酶会在每个sgRNA结合的地方造成小小的单链切口(SSB),两个相邻的单链切口会形成一个DNA双链断裂(DSB),DSB的形成会激起细胞以非同源末端链接(NHEJ)的方式进行修复,该过程中会引入插入、缺失或者突变(图1)。而在潜在脱靶区域,单个sgRNA造成的SSB会通过碱基切除修复方式精确修复该区域,不会引入突变。该合作课题组通过该技术同时敲除三个小鼠基因(包括Rag1和Rag2),同时提供了免费的在线资源序列查询网站。研究结果说明这一方法可以应用于其他物种的基因组改造,并显示出临床基因治疗的应用前景。3 l/ G8 N& T% g: V
& V3 @6 l8 @1 e3 f$ x图1: Cas9/Paired sgRNAs strategy
; n0 h( t3 J/ S5 g' Y2 ~" O% [0 A( d该课题研究得到了国家基础重大科学研究计划项目(2010CB945101和2011CB944301)和英国 Wellcome Trust 核心基金的资助;沈彬得到南京大学优秀博士研究生创新能力提升计划资助。
% D2 l' R" r' O) N- A4 c- L& k- h5 ]延伸阅读:% _. E( M6 k, P- [/ I6 K
Cell:里程碑成果!中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴
$ a' ]2 W. h: X2 n% `2 l" ~原文检索:
8 u% l' ^3 _, A) B* J% b) e/ qBin Shen, Wensheng Zhang, Jun Zhang, Jiankui Zhou, Jianying Wang, Li Chen, Lu Wang, Alex Hodgkins, Vivek Iyer, Xingxu Huang& William C Skarnes. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods, 02 March 2014; doi:10.1038/nmeth.2857& Q s% u. P! v/ W2 H! Z3 v
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2楼原文 感谢songzxj 提供 |
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