|
  
- 积分
- 8
- 威望
- 8
- 包包
- 898
|
作者：毛越苹， 陈明春， 黄咏菁， 曾凡钦作者单位：１． 中山大学附属第二医院皮肤性病科； ２． 广东省中医院皮肤性病科， 广东 广州 ) P& u. X' R0 v; H" }- g1 k( x
+ P6 O1 u) B5 b7 U) |
7 c+ M/ q1 x# G# w% j2 G
- S; m3 D' w; n |. a + S; `! `, l4 f
* U4 r6 y) g0 x$ |6 C
$ X# L! n, i. R. e7 R
A- V/ T/ @; g! {1 \0 J # D% P4 f: l2 g% W9 W
" ]- l7 Y* b U: q3 S
6 v0 `( U, i7 V8 [" o
' V. \7 y! J4 h2 f% d% b 【摘要】 【目的】 分离、纯化新生小鼠真皮间充质干细胞（ｍｄＭＳＣｓ），在体外培养、鉴定并标记，为ＭＳＣｓ的细胞学治疗开拓实用、简便的纯化方法。【方法】 采用低血清培养基，消化－贴壁－传代法体外培养ｍｄＭＳＣｓ，并对第３代ｍｄＭＳＣｓ从形态学、细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞周期和表面标记、细胞纯度等方面进行鉴定。ＣＭ-ＤｉＩ红色荧光蛋白标记所获取的ｍｄＭＳＣｓ。【结果】 培养的第３代ｍｄＭＳＣｓ细胞形态比较均一，主要为多角形、扯布状；生长曲线显示前５ ｄ ｍｄＭＳＣｓ细胞数呈指数递增，倍增时间约为２２ ｈ，第７天后进入生长平台期；流式细胞仪检测大部分ｍｄＭＳＣｓ处于静止期（Ｇ０／Ｇ１期：８７．２５％）；第３代ｍｄＭＳＣｓ ＣＤ４４＋， ＣＤ２９＋双阳性细胞为９２％；ＣＭ-ＤｉＩ标记ｍｄＭＳＣｓ的细胞密度、大小与光镜下所见基本一致。【结论】 组织消化－细胞贴壁－传代培养法能有效培养小鼠真皮ＭＳＣｓ，培养体系简便、稳定。红色荧光蛋白ＣＭ-ＤｉＩ对ｍｄＭＳＣｓ细胞能进行有效的标记。
( R$ Y( R; V9 C6 i 【关键词】真皮； 间充质干细胞； 小鼠
. Q G6 s& I# W, z Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｌａｂｅｌ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｒｍｉｓ-ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ
" r/ \' i) g" q. r+ f% r& o9 O8 L
ＭＡＯ Ｙｕｅ-ｐｉｎｇ１， ＣＨＥＮ Ｍｉｎｇ-ｃｈｕｎ１， ＨＵＡＮＧ Ｙｏｎｇ-ｊｉｎｇ２， ＺＥＮＧ Ｆａｎ-ｑｉｎ１
0 [" r3 O: N, C' y0 p# ?
: `, `) X: z: j" Z: J（ １． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｅｎｅｒｏｌｏｇｙ， Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， ＳＵＮ Ｙａｔ-ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０１２０， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｅｎｅｒｏｌｏｇｙ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０１２０， Ｃｈｉｎａ）
t0 J2 R% M% w* e4 T* G
8 ~* @& u; J* b# n9 X) eＡｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ， ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｂｅｌ ｏｆ ｎｅｏｎａｔａｌ ｍｏｕｓｅ ｄｅｒｍｉｓ-ｄｅｒｉｖｅｄ ＭＳＣｓ （ｍｄＭＳＣｓ） ａｎｄ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ＭＳＣｓ ｔｈｅｒａｐｙ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 Ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｅ ｍｄＭＳＣｓ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ-ａｄｈｅｒｅｎｔｅｄ-ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｌｏｗ-ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉｕｍ． Ａｎｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｍｄＭＳＣｓ ｂｙ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ， ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｋｉｎｅｔｉｃｓ， ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｍｄＭＳＣｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＭ-ＤｉＩ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】 Ｔｈｅ ｓｈａｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｐａｓｓａｇｅ ｏｆ ｍｄＭＳＣｓ ｗｅｒｅ ｑｕｉｔｅ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ， ｍａｊｏｒ ｐｏｌｙｇｏｎ ｏｒ ｃｌｏｔｈ-ｌｉｋｅ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ． Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｍｄＭＳＣｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ａ ｌｏｇａｒｉｔｈｍ ｍｏｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ５ ｄａｙｓ ｗｉｔｈ ２２ ｈｏｕｒｓ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ａｎｄ ｅｎｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｐｌａｔｅａｕ ａｆｔｅｒ ７ ｄａｙｓ． Ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｄＭＳＣｓ ｓｔａｙｅｄ ｒｅｓｔｉｎｇ ｓｔａｇｅ （Ｇ０／Ｇ１： ８７．２５％）． Ａｂｏｕｔ ９２．００％ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｐａｓｓａｇｅ ｏｆ ｍｄＭＳＣｓ ｓｈｏｗｅｄ ＣＤ４４＋ＣＤ２９＋ ａｎｄ ＣＤ８０－ＣＤ４５－． Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＭ-ＤｉＩ ｗｅｒｅ ｃｌｅａｒ ａｎｄ ｂｒｉｇｈｔ， ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｈａｐｅ ａｎｄ ｓｉｚｅ ｕｎｄｅｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】 Ｔｈｅ ｍｄＭＳＣｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ-ａｄｈｅｒｅｎｔｅｄ-ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｌｏｗ-ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｙ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ． Ｔｈｅ ｍｄＭＳＣｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＭ-ＤｉＩ．
5 B9 z& s$ W7 _: G7 S! B! z& P
) v1 x! o; L3 p% N2 N$ iＫｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｄｅｒｍｉｓ； ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ； ｍｏｕｓｅ7 E8 h0 E9 J9 J7 C" A1 |/ \8 @) }
4 B6 F2 }. B' D9 U# R; M
［Ｊ ＳＵＮ Ｙａｔ-ｓｅｎ Ｕｎｉｖ（Ｍｅｄ Ｓｃｉ），２００８，２９（６）：７５３－７５７］
2 H+ W# I2 q! P/ x" n( g: f0 g9 D1 {! p) e9 G# q
近年来对于间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）的自我更新和体外扩增的能力及其多向分化的潜能已经被广泛认识，已在骨髓［１］、骨膜［２］、脂肪［３］等组织中证实有ＭＳＣｓ的存在。骨髓ＭＳＣｓ的发现最早，分离、培养技术较成熟，但真皮ＭＳＣｓ的分离、纯化相关研究较少，而皮肤作为人体最大的组织器官，可提供大量的种子细胞，且取材方便，故选择真皮ＭＳＣｓ作为细胞治疗的种子细胞，具有广阔的应用前景。ＭＳＣｓ的分离依赖于它的贴壁能力， 本实验成功地建立了简便、稳定的真皮ＭＳＣｓ的培养体系，分离、培养了新生小鼠的真皮ＭＳＣｓ（ｍｏｕｓｅ ｄｅｒｍｉｓ-ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｍｄＭＳＣｓ），并采用红色荧光蛋白ＣＭ-ＤｉＩ进行标记分离、纯化的ｍｄＭＳＣｓ，便于对移植细胞的定位、示踪。
) K! I5 f% I4 Q0 Z, ]3 @ `6 X
" u: k3 t2 t) J+ P１ 材料与方法
/ v1 `" s: H3 H1 X8 N/ }0 E7 l7 B% _: o2 Y
１．１ 材 料 J5 s( l' T" C( s# ?* N
# c, W( i0 T) V6 X9 o$ Y5 @2 a* q
选用出生１ ｄ的雄性ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，购自中山大学实验动物中心。
3 ?, ^. b2 e6 Z( U2 b) O% H+ {& |+ t# {3 s$ h/ r4 |* H1 {: x
１．２ 试 剂8 u( c% I X& Z9 L3 q
4 J- k% u1 t2 \9 v$ S* C: {
低糖ＤＭＥＭ培养液，胎牛血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ），０．２５％ＥＤＴＡ－胰酶Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，美国）购自华美生物工程公司广州分公司；细胞周期检测试剂盒购自武汉博士德公司；生物素结合的大鼠抗小鼠－单克隆荧光抗体ＣＤ４４-ＰＥ，ＣＤ２９-ＦＩＴＣ，ＣＤ８０-ＦＩＴＣ，ＣＤ４５-ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，德国）购自深圳科润达生物科技有限公司；红色荧光蛋白ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ?誖ＣＭ-ＤｉＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，美国）购自广州英韦创津生物科技有限公司。& B) @* H+ E3 V
; n9 \7 K1 h# N１．３ 方 法2 B! K) z# ?& J J; p+ _" W
7 a; |* C! F f& o7 c4 Q( Q
１．３．１ ｍｄＭＳＣｓ的分离、培养 小鼠断颈处死，无菌条件取躯干部皮肤，去除皮下脂肪及疏松结缔组织，将标本剪成尽可能小的组织块，置于０．２５％胰蛋白酶中，３７ ℃水浴，观察到胰酶已将表、真皮分离，溶液呈糊状，培养液（含血清）中和后离心、弃上清，培养液重悬，置于培养瓶中，３７ ℃，５％ＣＯ２温箱中静置培养４８ ｈ后，去除未贴壁细胞，继续培养贴壁细胞，并按１：２传代。; R+ G4 f4 z t
6 K( G% Z; f( V G& x% t+ t１．３．２ 第３代培养细胞的鉴定 （１）培养细胞生长曲线的绘制：培养细胞种于１２孔板，分别计０，２，４，６，８，１０，１２ ｄ细胞数，绘制生长曲线。（２）培养细胞细胞周期的测定：待测细胞常规胰酶消化后，７０％乙醇固定，流式细胞仪检测细胞ＤＮＡ含量。（３）流式细胞仪检测培养细胞的表面标记：培养细胞ＰＢＳ重悬。稀释至终浓度约６ １０６／ｍＬ。离心后细胞用２００ ?滋Ｌ抗体孵育液重悬，分为２管，一管为空白对照，另一管加入ＣＤ２９-ＦＩＴＣ， ＣＤ４４-ＰＥ双标，避光孵育４ ℃以下，１ ｈ。ＰＢＳ重悬后，上机检测。5 t+ {4 K1 }8 }
2 q( w; T4 R$ k) R0 }
１．３．３ ｍｄＭＳＣｓ的标记 无水乙醇溶解ＣＭ-ＤｉＩ配制１ ?滋ｇ／?滋Ｌ ＣＭ-ＤｉＩ溶液。吸去细胞原有培养液，ＰＢＳ冲洗后加６００ ?滋Ｌ ＣＭ-ＤｉＩ工作液，３７ ℃放置５ ｍｉｎ，４ ℃放置１５ ｍｉｎ。吸去染液， ＰＢＳ冲洗后加适量培养液于孵箱中继续培养４ ｈ。倒置相差显微镜下观察染色后的细胞。- V$ O9 D) O' X$ a, c ]- b) x
, t1 f3 y! s+ {$ ~' a２ 结 果
$ l* L6 k# ~7 p" G$ u$ Z4 t& k. Q- Y7 V' V
２．１ ｍｄＭＳＣｓ的形态和生长情况
8 N& y" [6 ~! ]" }8 J( o+ z5 w5 o/ X' I* P9 X
培养后２４ ｈ，倒置显微镜下已观察到有细胞贴壁生长，４８ ｈ后，贴壁细胞增多，具有成纤维细胞形态，可见表皮细胞呈铺路石样生长；第４天，细胞生长良好，大部分贴壁，约铺满瓶底６０％，可见克隆性生长，胞浆丰富，胞核边缘清，胞质清楚，呈菱形或梭形，成纤维细胞样，平行排列或漩涡样生长，部分细胞正处于分裂增生状态；第６天，大部分细胞完全伸展，并有小部分密度大的地方达到接触抑制，约铺满瓶底８０％，原代培养结束，传代。培养的原代ｍｄＭＳＣｓ形态异质性较大，以梭形和多角形为主，细胞体积较大。传代培养至第３代以后，细胞形态比较均一，主要为多角形、扯布状（图１）。6 I& [. g! W0 c8 \! [0 Q
+ ~* a7 Q3 ~1 l; t3 ?0 C: }* f
２．２ 生长曲线的分析7 E! X4 J- N3 Y2 w$ j3 C" ^6 s
+ t; k+ O, b. `2 X9 d- a! P
ｍｄＭＳＣｓ生长曲线测定的结果显示，此方法分离的ｍｄＭＳＣｓ具有很强的增殖活性，前５天为细胞数呈指数递增，此期为对数增殖期；第５天后，细胞生长曲线显示ｍｄＭＳＣｓ的生长进入平台期。在细胞生长的对数期，ｍｄＭＳＣｓ的倍增时间约为２２ ｈ（图２）。! _' R+ m% k b
2 D" B1 L+ ?1 C( [! K) h* i5 p: z
２．３ 流式细胞仪检测细胞周期
; {- a, w% c! r0 H3 j; \! ^1 o0 [
Z1 D& j _9 l: Y流式细胞仪检测ｍｄＭＳＣｓ细胞内的ＤＮＡ含量显示，大部分细胞处于静止期（Ｇ０／Ｇ１期：８７．２５％），只有少部分处于分裂期（Ｇ２／Ｍ＋Ｓ期：１１．１２％，其中Ｇ２／Ｇ１期：１．６３％）。
2 e1 V! G* R* e1 Q8 K# W
; C7 h6 \- @) U2 G: Q２．４ 流式细胞仪检测细胞表面标志/ a5 x. v! A) a
1 A3 p1 }) b; O% }
流式细胞仪检测第３代ｍｄＭＳＣｓ的表面标志显示ＣＤ４４＋者９９．７％，ＣＤ２９＋者９８．９％，ＣＤ８０－者９９．１％，ＣＤ４５－者９９．７％，其中ＣＤ４４＋和ＣＤ２９＋双阳性细胞约为９２％（图３）。% g7 G( Y% W5 @
& z* ]4 U w! q8 B1 e: e２．５ ｍｄＭＳＣｓ的荧光蛋白标记1 _" [5 ]$ S$ S+ G) G- z
# L7 L! y8 m0 O2 M: b, D! C
ＣＭ-ＤｉＩ标记后ｍｄＭＳＣｓ于荧光显微镜下观察，可见细胞胞浆红染，细胞标记良好，细胞密度、大小与光镜下所见基本一致（图４）。& L: F" m& C% d' ]
2 h* |; B$ Y! C ３ 讨 论
) Q$ i; l: h, A! Q; r4 k3 p K
" H4 f! b; B$ v& c5 ~0 J近年来，关于组织干细胞跨系统、跨胚层分化的报道很多，已得到了充分的证实。成体干细胞是个体发育过程中胚层干细胞存留于多种组织中的干细胞群，因各自所处的微环境不同而向不同的组织分化，但其仍具有多系分化潜能。ＭＳＣｓ是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞，大量研究已从骨髓、脂肪、滑膜等处分离出ＭＳＣｓ，而骨髓来源ＭＳＣｓ的研究相对较多［４，５］，对于其它组织来源的ＭＳＣｓ的研究尚少，可靠、重复性好的分离培养方法也未有效地建立。国内史春梦等［６］采用含有血清的培养基对新生大鼠真皮的ＭＳＣｓ的培养进行了尝试，分离的细胞可以在体外长期增殖，能够向成骨细胞和软骨细胞分化。Ｔｏｍａ等［７］采用无血清培养基对小鼠和人类的皮肤的前体细胞进行培养，细胞可以分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞，这种细胞在含有血清的培养基中培养也可以增殖。近期，Ｄａｎｉｅｌ等［８］也从成人头皮皮肤中分离出ＭＳＣｓ，于含表皮生长因子和成纤维细胞生长因子的培养基中培养，并成功诱导分化成神经细胞。为尽量避免转化生长因子对ＭＳＣｓ各种生物学特性的影响，我们在总结文献的基础上，利用ＭＳＣｓ具贴壁的特点，采用含低血清（５％ＦＣＳ）、不含分化生长因子的塑料培养瓶进行培养。同时，为尽可能地获得生长稳定的细胞，本实验于４８ ｈ弃去未贴壁细胞，继续培养贴壁细胞。从第３代细胞的生长曲线绘制上看，此方法分离的第３代ｍｄＭＳＣｓ具有很强的增殖活性，前５天细胞数呈指数递增，此期为对数增殖期；第６天后，细胞生长曲线显示ｍｄＭＳＣｓ的生长进入平台期。在细胞生长的对数期，第３代ｍｄＭＳＣｓ的倍增时间约为２２ ｈ。此外，处于静止状态也是干细胞的一个重要特性，我们通过流式细胞仪检测培养获得的ｍｄＭＳＣｓ发现，大部分细胞（８７．２５％）处于Ｇ０／Ｇ１期，也支持培养的细胞为间充质干细胞。
2 K2 O5 I N, p& F2 t2 p: c& P# K9 z! X; C. ^' c
由于ＭＳＣｓ并没有找到理想的特异标记分子，其在组织中的确切表型仍存在争议，国际细胞治疗学会（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｂ Ｔｈｅｒａｐｙ）最近发布了关于这类始祖细胞的命名和鉴定的共识［９］。研究表明，ＭＳＣｓ在形态上呈纺锤形的成纤维细胞状，能附着在塑料或玻璃培养皿上生长形成均匀的集落或贴壁的融合层［１０］。它既有间质细胞的表面抗原特征，又有内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞的表面抗原，但不表达造血细胞的表面标志，如ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４等，也不表达与人白细胞抗原（ＨＬＡ）识别有关的的共刺激分子Ｂ７１（ＣＤ８０）、Ｂ７２及主要组织相容性复合物Ⅱ分子等。ＭＳＣ主要表达：黏附分子，如ＣＤ５４、ＣＤ４４等；生长因子和细胞因子受体；整合素家族成员，包括ＣＤ４９、ＣＤ２９等及其他［１１］。我们的实验也对所分离、培养的细胞进行了表面标志的流式细胞仪检测，结果第３代ｍｄＭＳＣｓ的表面标志显示ＣＤ４４＋，ＣＤ２９＋，ＣＤ８０－，ＣＤ４５－，其中ＣＤ４４＋， ＣＤ２９＋双阳性细胞约为９２％，符合文献报道的ＭＳＣｓ的表面标志特征，从而证实了我们采用含低血清（５％ＦＣＳ）、不含分化生长因子的塑料培养瓶更为简便地获取了小鼠来源的真皮ＭＳＣｓ，且第３代ｍｄＭＳＣｓ的增殖速度快，细胞形态一致，纯度较高（９２％）。! G$ b6 t- s; m! O5 {
' @: F6 A N. g4 `& r: ?$ W7 [
１，１′－双十八烷－３，３，３′，３′－四甲基吲哚羧花青－高氯酸盐（ＤｉＩ）是一种亲脂性碳花青染料，不溶于水，易嵌入生物质膜作侧向扩散运动，从而标记整个细胞膜，还可以通过活体细胞的胞饮作用进入胞浆，从而标记整个细胞浆。ＤｉＩ使用简便，染色速度快，且可使活体细胞均匀染色，是一种非常理想的荧光染料。此外，ＤｉＩ对活体细胞没有任何毒性，不从已标记的细胞转移到未标记的细胞，且荧光衰减慢，将含ＤｉＩ的脑组织储存一年，未见衰减现象［１２］。我们实验使用的ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ?誖ＣＭ-ＤｉＩ 为ＤｉＩ的衍生物，在ＤｉＩ中加入了具有中度巯基反应特性的氯甲基取代物，后者能与细胞内含巯基的肽和蛋白结合，使得ＣＭ-ＤｉＩ能够抵抗醛类的固定作用。对间充质干细胞的标记可使用ＣＦＳＥ、ＤｉＩ、ＰＫＨ２６［１３］等荧光染料，但ＣＭ-ＤｉＩ在细胞固定、破膜及石蜡包埋的整个过程中均能很好的保留在细胞内，因此更适于固定后标本的长期示踪［１４］。实验中将ＣＭ-ＤｉＩ标记后ｍｄＭＳＣｓ于荧光显微镜下观察，可见单个清晰红色光点，细胞标记良好，细胞密度、大小与光镜下所见基本一致，证实标记成功。
$ p3 U: {2 Z, D; w8 `' L, \5 b' Z
9 @+ X' N8 n! ?4 @0 ?综上所述，我们的研究成功的采用含低血清（５％ＦＣＳ）、不含分化生长因子的塑料培养瓶获取了小鼠来源的真皮ＭＳＣｓ，且应用ＣＭ-ＤｉＩ可成功对所获取的ＭＳＣｓ进行荧光标记。由于皮肤方便取材，且增生速度快，因此，建立有效的真皮ＭＳＣｓ分离培养和标记方法，为今后ＭＳＣｓ的研究、应用提供了更具前景的途径。
% r# o% s8 |2 H2 k7 X Y9 L" t 【参考文献】) s/ w9 u# @2 }/ y. }. X2 f& B
Ｚｈａｎｇ Ｃ， Ｈｕ Ｙ， Ｘｕ Ｊ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｏｎｅ-ｒｅｌａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ［Ｊ］． Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｘｉｕ Ｆｕ Ｃｈｏｎｇ Ｊｉａｎ Ｗａｉ Ｋｅ Ｚａ Ｚｈｉ， ２００５，１９（１１）： ９０６－９０９．, b/ J; V/ s z6 l" F' @
* B8 W2 }- n" @ B1 h
) D+ f8 g2 f1 _4 t% o5 e! j! N4 ?
Ｄｅ Ｂａｒｉ Ｃ， Ｄｅｌｌ′Ａｃｃｉｏ Ｆ， Ｖａｎｌａｕｗｅ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｏｓｔｅａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ-ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ［Ｊ］． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ， ２００６，５４（４）：１２０９－１２２１．% }& d& V- |* E8 b
: Y9 [/ u( W, R2 b7 Z4 y; b4 a
1 k! F6 o, O( w' k# {" q
- O; ^* X8 o! z# V+ F- Q Ｌｅｅ ＲＨ， Ｋｉｍ Ｂ， Ｃｈｏｉ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ２００４，１４（４－６）：３１１－３２４．* h; Y% e' A8 L+ p
8 ~4 Q# l; i5 @3 T) h7 V _: ?
- g) M Q; u& `& |5 b- G+ O" e) e
1 F* d3 t! x# M2 d1 W% W0 x
康德志，林建华，余良宏，等． 大鼠骨髓间充质干细胞静脉移植对脊髓损伤的修复作用［Ｊ］． 中华神经医学杂志，２００６，５（１１）：１１１７－１１２１．
! {( T& i# u" o3 B" a
d" X, ]) n1 I8 d, u. l" F* X$ ?4 m1 y9 A+ \4 Y- b3 J
6 k1 Q/ `: E1 ~7 g
华 平，熊利华， 张 华，等． 体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞［Ｊ］． 中山大学学报：医学科学版，２００４，２５（１）：６７－６９，７６．, |) ?# T( g3 h. a
, Z5 R/ @( J9 v7 [6 K" }0 U5 c; ]2 o4 M; m
2 q5 n' t8 {8 M" n" Y; `/ G+ q 史春梦，程天民． 大鼠真皮间充质干细胞的体外长期培养及胶原海绵对其生长的影响［Ｊ］． 生物医学工程学杂志，２００２，１９（４）：６６０－６６３．
& W0 j, B2 q8 }. [) O _2 ]' ]
( T9 r5 T1 E( a: u. c
1 q/ U- v: |) e3 f7 h% M) x+ K7 y5 Z( K/ q2 H
Ｔｏｍａ ＪＧ， Ａｋｈａｖｅａｎ Ｍ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ＫＪ， ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔａ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｅｒｍｉｓ ｏｆ ｍｎｍｍａｌｉａｎ ｓｋｉｎ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ２００１，３（９）：７７８－７８０．0 u' g! U1 \/ V
5 P% ~3 N( v. S, ~3 G0 {' ^ X) G, H- t0 q: p. @9 n! J! v
9 H& E7 `. y7 B. x3 }5 K9 Z Ｓｈｉｈ ＤＴ， Ｌｅｅ ＤＣ， Ｃｈｅｎ ＳＣ， ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｃａｌｐ ｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］． Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ， ２００５，２３（７）：１０１２－１０２０．# L7 p1 e/ V3 R P6 c/ x
) a: W' i L4 V! f
) ^* ~$ S+ {) U( X0 S+ O
8 G' F0 ?4 J. O6 d( R+ A; v8 r Ｈｏｒｗｉｔｚ ＥＭ， Ｌｅ Ｂｌａｎｃ Ｋ， Ｄｏｍｉｎｉｃｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ＭＳＣ： ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ， ２００５，７（５）：３９３－３９５．
1 z. z; X8 ~: ?0 S
4 [0 ?# Z5 Y s" T0 G; o8 J1 h. m( ]1 @1 I. |% \
3 z' ~( K5 \! G6 |# A Ｔｏｎｄｒｅａｕ Ｔ， Ｌａｇｎｅａｕｘ Ｌ， Ｄｅｊｅｎｅｆｆｅ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＭ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｐｌａｓｔｉｃ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｒ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ： ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ， ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ［Ｊ］． Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ， ２００４，６（４）：３７２－３７９．4 c; B4 ~% D4 \& d7 ^6 h) ?
0 ~9 j4 p- d; ` i2 a s* X$ c$ K( Q6 T0 g; W2 ~. k: H% ^
, p* H v. d' W9 W 廖联明，韩 钦，赵春华． 间充质干细胞在免疫治疗中的应用［Ｊ］． 中国实验血液学，２００５，１３（１）：１５８－１６３．( U0 V9 M( [# ]: |3 v- S& [
, S: y' O6 W4 |, I
" m3 e; h; D* x J0 a
" v' X* Y `$ Z5 ^4 f7 o# Z 孔国英，刘忠浩，帅建忠，等． ＤｉＩ在已固定脑组织中的示踪研究［Ｊ］． 湖南医科大学学报，１９９４，１９（１）：７０－７２．" I/ W, s+ r9 h9 c& j7 u
6 }5 U) E% r% H; N
8 D3 F$ T, i7 Y6 r. }
5 z8 v0 x8 N. N4 b" d# L
王 彤，黄子通，符 岳，等． 心肌梗死后骨髓间充质干细胞治疗改进心功能及心肺复苏结果的研究［Ｊ］． 中山大学学报：医学科学版，２００７，２８（５）：５２９－５３４．" U5 o* W& ^. x2 t( ^4 [) f
+ ^4 [( [# w, f: P: B
4 w7 q) R: ^5 k
0 V$ j% e2 u; q) j5 B0 l& z, S Ｈｅｍｍｒｉｃｈ Ｋ， Ｍｅｅｒｓｃｈ Ｍ， Ｖｏｎ Ｈｅｉｍｂｕｒｇ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｙｅｓ ＣＦＳＥ， ＣＭ-ＤｉＩ ａｎｄ ＰＫＨ２６ ｆｏｒ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ［Ｊ］． Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ，２００６，１８（３－４）：１１７－１２７． |
|
发表于 2009-3-3 12:22
发表于 2015-6-28 15:26
