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发表于 2009-2-28 08:13 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

端粒酶研究概况及TRAP微孔板杂交法检测的应用

南通医学院附属医院王惠民1 Z5 i3 R' D; E3 r# I6 `; r& g
, c! ^7 V$ r6 s  j' V

一、端粒0 f% U2 d8 i, q
七十年代末，Blackburn 等在进行染色体研究时，发现被破坏的染色体末端十分不稳定，损伤的末端可相互融合。因此，将这种可使染色体保持稳定的末端称之为"端粒"(telomere)。此后的研究结果表明，几乎所有的真核细胞都存在端粒，不同真核细胞的端粒有着类似的DNA序列和结构，端粒高度保守，一般由极其简单的串联重复序列组成。例如人与其它脊椎动物是5`TTAGGG，重复次数为2000个左右，不同细胞的端粒长度不一，人精子约为15kb，而外周血细胞为10kb。
不同物种间端粒核苷酸构成可能不一样，如四膜虫为TTGGGG，酵母为TG1-3，Euplotes为TTTTGGGG。它们的共同点是富含G，并且富含G的链(5`→3`)较相对应的富含C的链(3`→5`)突出12－16个核苷酸，其突出部分为端粒合成的起始点，在此基础上延伸端粒，另一链则在DNA聚合酶催化下按互补原则合成。4 A+ w& B5 s1 |6 N: Q, m
端粒在细胞中包括同核膜在内的一些核蛋白结合形成复合物，使端粒免受化学修饰和核酸酶降解或发生有害的重组，如末端融合、重排、染色体易位或染色体缺失等。另外，因DNA不能从头合成，由于端粒的存在可避免遗传信息的丢失。
正常体细胞每次分裂后，染色体丢失50～200bp端粒核苷酸序列。Harley等比较47例20～79岁人血液细胞端粒序列长度，见青年组比老年组长，显示端粒序列长度随年龄增长在而逐步缩短，这可能是衰老发展的一种内在机制，因此大多数作者认为端粒长度是"细胞寿命之钟"(mitotic clock)。2 c- j+ f# w) q  B
二、端粒酶  d; |+ g* r3 M9 g
1985年，Greider和Blackburn首次证实一种不需要模板即可在四膜虫染色体3`端按上TTGGGG端粒的酶――端粒酶(telomerase)。/ G* @- T% U- I: n9 V, L
端粒酶是一种核糖核酸蛋白酶，由核酸与蛋白两部分组成，作为依赖RNA的一种特殊DNA聚合酶，属逆转录酶。只要存在dNTPs，可催化形成富含G的端粒片段并接到DNA末端。" [% u( W( C$ a7 Q* Y
端粒酶结构中的核酸部分为RNA，又分为模板区与非模板区，模板区决定所合成端粒的特异性，非模板区具有酶与底物的结合位点。不同物种端粒酶RNA部分的核苷酸组成不一样，如Euplotes有191个核苷酸，模板区为5`CAAAACCCCAAA，鼠端粒酶RNA有430个核苷酸，小鼠模板区为5'CCUAACCCUGAG，大鼠模板区为5'UCUAACCCUAUU，中国仓鼠模板区为5'UCUAACCCUGAA，人端粒酶RNA(hTR)有445个核苷酸，模板区为5'CUAACCCUAAC。模板区长度一般为端粒重复片段长度的1～1.5倍。如在细胞中加入端粒酶RNA的反义寡核苷酸，端粒酶活性受到抑制，改变端粒酶RNA模板区的部分核苷酸，则端粒酶合成精确性发生改变，端粒延伸失控，细胞生长受到损害。了解端粒酶RNA的核苷酸序列，除可了解端粒酶作用机理外，还可有利于端粒酶测定的引物设计，或设计相应的反义寡核苷酸以研究如何阻止肿瘤的生长。
由于端粒酶在细胞中含量极少，现有提取蛋白质的方法，很难纯化酶蛋白部分，因此对酶蛋白的研究显得十分艰难。1995年Collins等于四膜虫中发现称为P80与P95的二种蛋白质具端粒酶活性，1996年Lendvay等在酵母细胞中发现与端粒酶活性有关的Est2蛋白，1997年Lingner等在纤毛虫中发现P123与P43等蛋白质具端粒酶活性，此后证实Est2与P123均含有逆转录酶结构，因此初步肯定为端粒酶亚单位。同年Nakamura等与Meryerson等分别从各自的实验室几乎同时克隆出人的端粒酶亚单位基因，发现与P123及Est2具相似的逆转录酶结构，其氨基酸序列的一致性为24～30％，而与其它的逆转录酶差距较大。该蛋白质被命名为hEst2或hTRT，而Counter则主张依据国际基因组数据库命名委员会的原则命名为hTERT（human telomerase reverse transcriptase），已证实编码该蛋白质的基因位于5号染色体短臂。Counter等通过异位表达所产生的hTERT具有端粒酶活性，但这些蛋白质是怎样与RNA组成全酶的，促使hTERT高度表达的机制如何，目前正是科学家们研究的热点。! }6 F+ P% P1 ]4 c
1997年Hrrington 等与Nakayama等发现了端粒酶相关蛋白(telomerase-associated protein，TP1/TLP1)。现在已有较多的作者倾向于端粒酶的全酶分子是由hTR、TP1与hTERT共同组成的。他们同时测定正常组织与肿瘤组织的hTR、TP1 mRNA、hTERT mRNA，发现hTRET mRNA与端粒酶的活性相一致，正常组织阴性，80％以上的肿瘤组织呈强阳性，hTR与TP1 mRNA在正常及肿瘤组织均可出现，且与端粒酶活性无相关性。以上结果提示，hTERT可能是合成端粒酶全酶限速步骤，与肿瘤的关系更为密切。
三、端粒酶与肿瘤诊断+ p% z& h# b9 v) N$ V
DNA在复制时，需要一段RNA作为引物，复制完毕后RNA被水解掉。因此在细胞有丝分裂过程中染色体两端的端粒不断丢失，当端粒缩短到一定长度时，可能会触发某种信号，使细胞进入永生化Ⅰ期即M1期，此时细胞不再分裂，退出细胞周期而老化。如果此时细胞被病毒转化、癌基因激活或抑癌基因失活，细胞便可越过M1期继续分裂，端粒继续缩短，最后进入永生化II期即M2期。多数细胞由于端粒太短而失去功能并死亡，但极少数细胞的端粒酶在此阶段被激活，从而恢复端粒的功能，使细胞逃避死亡而获得永生化(immortalization)，成为具无限生殖能力的肿瘤细胞。但亦有人认为端粒长度与端粒酶激活并不存在必然联系，至今尙不能最终确定端粒酶激活的分子途径。
正常人体组织中，仅生殖细胞、造血细胞等胚胎性干细胞中存在高端粒酶活性，其它组织中基本测不到端粒酶活性或活性较低。Kim等检测100株人肿瘤细胞系的端粒酶活性，98％呈阳性，而22个正常细胞株均为阴性。有作者总结909例恶性肿瘤组织发现端粒酶活性升高占84.3%，而325份正常组织端粒酶活性异常仅3.4%。我们近年来的测定结果如附表：
附表不同肿瘤组织或胸腹水端粒酶检测结果
样本来源例数阳性数（%）对照例数* 阳性数(%)$ T4 W" m3 V$ g9 O
子宫内膜癌 2 1 1 0; o' A( P( K  b4 N# U
膀胱癌 2 2 －－
卵巢癌 4 4 2 1
胆囊癌 1 1 －－
胃癌 1 1 1 0! A3 H5 ~" l$ U. _( I) K8 ?7 _; r
结肠直肠癌 2 2 2 0- d' n3 i% D. }$ j. O  ^
肺癌 29 26 18 0
食道癌 48 43 28 4
恶性胸腹水 29 24（82.3） 14 2（14.3）
合计 118 104（88.1） 66 7（10.6）
* 对照为肿瘤远端组织或良性胸腹水
Tahara等测定了105例各种肝病的端粒酶活性，发现肝癌组织中端粒酶阳性占85％，慢性肝病组织为55％，HBV阳性的肝癌其端粒酶100％阳性，而正常肝组织中未检测到。Kazuhiro等改良了Tahara的测定方法，提高PCR退火温度，改用半定量测定，25例肝癌组织端粒酶阳性率为80％，癌旁组织为37.9%，肝炎与肝硬化为17.7%，正常肝组织未见端粒酶活性，强阳性仅出现于肝癌组织，为64%。不少作者均观察到慢性肝病中端粒酶阳性率较肝癌者为低，且高分化肝癌较中分化者为低，部分端粒酶阳性的肝硬化病人可发展为肝癌，因此作者推测，端粒酶阳性细胞可能发生于肝癌形成的早期，通过肝穿刺标本测定端粒酶活性可能有利于肝癌的早期诊断。) Z: ?% m/ h& |; [2 ~
不同作者测定肾细胞癌的端粒酶71－74％阳性，31例癌旁组织3例阳性。肾血管平滑肌脂肪瘤阴性。不同细胞类型或组织学分期的肾癌端粒酶活性无显著差异。Rahat等测定来自于膀胱癌的5637细胞株，端粒酶呈强阳性，肾孟，输尿管与膀胱等组织移行细胞癌端粒酶90～100％阳性,相对应的正常组织阴性。对21例膀胱癌的尿中脱落细胞分析，开始仅发现4例阳性（19％），将尿细胞抽提物经系列稀释后，17例阳性（81％），说明尿中存在抑制物，尿标本中端粒酶活性与膀胱肿瘤的恶性程度无明显相关性。在膀胱癌周围组织尽管没有发现病理学的改变，但端粒酶阳性率为69％，因此作者推论尿中脱落细胞端粒酶测定可作为简易的膀胱肿瘤诊断与复发的指标，膀胱活检酶测定可作为肿瘤的癌前诊断。9 z1 _4 E0 U0 g
Tatematsu等发现在正常人外周血细胞有极低的端粒酶活性，偶见有高活力者。有文献报道，与相应年龄正常人外周血细胞的端粒酶活性比较，急性白血病患者外周血白细胞端粒酶活性明显增高，阳性率达81.8%，随着病情的缓解端粒酶活性下降，缓解后端粒酶活性仍有轻度或中度增高者，提示复发可能。端粒酶活性高的白血病患者预后较差，存活率较低。Ohyeshiki等发现，慢粒慢性期端粒酶活力较低，急变期活性明显增高。Kosugi等发现33%MDS端粒酶活性异常。我们也发现正常人外周血细胞端粒酶活性较低，慢粒急性期高于慢性期，在MDS中13.3%端粒酶阳性，因此，外周血细胞端粒酶活性的检测是否可用于预测慢粒急变和MDS向白血病的转化，值得进一步探讨。
Anderson等测定10例子宫颈癌发现端粒酶全部阳性，而正常组织均阴性。Snijders等发现子宫颈轻度与中度非典型增生未检出端粒酶活性，重度非典型增生阳性率为40%，鳞癌为96%，提示端粒酶可作为鳞癌的癌前病变指标。而Wisman等发现子宫颈刮片和组织活检的结果有较大的差异，其原因待进一步阐明。Kyo等发现正常子宫内膜端粒酶活性与月经周期有关，在增生期95%阳性，经期42%阳性，绝经后52%阳性，在子宫内膜增生期进入经期时端粒酶活性急剧下降。将以上各种组织样本经100倍稀释后，仅52%增生期端粒酶阳性，其它均为阴性，此时恶性肿瘤组织仍呈强阳性反应，提示可用定量或半定量方法区别正常组织与肿瘤组织。0 L# S4 i; H* \2 u- l
Hiyama等检测66例胃癌组织及癌旁组织，85%肿瘤组织显示端粒酶活性，端粒酶阳性者往往属于进展期胃癌，且瘤体较阴性者大，病人生存期期较阴性者都短。遗传性非息肉性结直肠端粒酶阳性率达77％，散发性结肠癌81％，，二者无显著差异，前者虽发病年龄较小，但同样可激活端粒酶表达。
Yashima等在部分良性乳腺肿瘤检出低活力端粒酶，94％乳腺癌端粒酶阳性，并发现端粒酶活力随肿瘤进展而升高。Hoos等发现100%的乳腺癌端粒酶阳性，活性显示与肿瘤大小、是否有淋巴结转移有关，而与临床症状无关。无一例外的是，在化疗后端粒酶活性呈快速下降，Sugino等发现正常乳腺组织存在端粒酶抑制物，去除这些抑制物后，可由端粒酶阴性转为阳性反应，其机理尚不明了。" @' u2 t7 C: w) [: C
Yashima等检出肺癌组织端粒酶阳性率为94.9%，与hTR有较好的相关（83%）。Hivama等检测136例原发性肺癌的端粒酶阳性率为80%。我国学者张行等在肺癌患者纤维支气管镜刷落细胞中检出端粒酶91.3%阳性，明显高于同期进行的毛刷刷落细胞涂片病理学诊断阳性率（52.2%），肺部不典型增生亦显示有端粒酶活性（83.3%），远高于肺炎（15％），张伟等在43例明确诊断肺癌的癌性胸水中，细胞学诊断的阳性率为67.4%，端粒酶阳性率为76.7%。我们在29例恶性胸腹水检出24例（82.8%）端粒酶阳性，良性胸腹水为14.3%（2/14），提示端粒酶活性检测可用于良恶性胸腹水的鉴别诊断。
除以上论述的肿瘤外，几乎在各种恶性肿瘤中都可见端粒活性升高。有人总结近年文献，其它各类肿瘤的端粒酶活性表达情况大致如下：头颈部鳞癌90％，脑肿瘤66～94％，卵巢癌100％，胰腺癌95％，前列腺癌78～90％，神经母细胞瘤94％。值得注意的是，各种组织的穿剌标本、活检标本、尿标本、膀胱和肠冲洗液及胸腹水中端粒酶活性的检测，可望广泛用于临床，以辅助有关肿瘤的早期诊断与预后。
四．端粒酶活性的抑制与肿瘤治疗
端粒酶与恶性肿瘤的关系已为人们所共识，如何阻抑端粒酶作用从而达到抑止肿瘤的生长，是极具重要意义的研究课题。人们试图从诱导细胞分化阻抑酶的表达，阻断端粒酶RNA模板及酶蛋白的作用等方面进行研究。# r& K2 o# y/ n& y' M/ P
Xu等发现用维甲酸（RA）和维生素D3分别诱导人早幼粒白血病HL－60细胞分化为成熟的粒细胞和单核细胞时，端粒酶活性明显下降，并发现端粒酶活性抑制程度与分化程度呈正相关。这种诱导分化主要使细胞内基因调控发生改变，从而影响端粒酶RNA或蛋白亚基的活性表达。但对于有些肿瘤细胞如黑色素瘤CM73-76和神经胶质瘤Ast812细胞株，分化诱导并不能下调端粒酶活性。  ^. w8 [* B9 a! n
Feng等于1995年首先用反义人端粒酶RNA转染人Hela细胞，由于与hTR的互补作用，使端粒酶失去活性，Hela细胞的端粒DNA逐渐丢失，细胞经23～26个倍增周期后开始死亡。Norton等设计了一组与hTR互补的肽核酸（Peptide nucleic acids，PNAs），其抑制端粒酶活性的作用是上述反义hTR的10～50倍。由于核酶（Ribozyme，RZ）具有特殊核酸内切酶的活性，Kanazawa等设计了一种锤形核酶，可特异切割hTR模板区序列，将此与肝癌细胞株HepG2及Huh7共孵育后，端粒酶活性受到明显抑制。/ b. s' i' b. {" j) ~- }
由于端粒酶是一种逆转录酶，有人尝试将治疗艾滋病的逆转录酶抑制剂用于治疗肿瘤，但效果不甚理想。Collins制备抗四膜虫端粒酶蛋白P80抗体，可免疫沉淀端粒酶，由于人端粒酶蛋白TP1和P80具很高的同源性，抗P80抗体具抑制人端粒酶活性的能力，但这种免疫抑制作用还未被广泛证实。  D) J  @' X; k' s6 @# t
由于端粒酶的表达调控过程、端粒酶分子本身的结构尚未十分明了，酶蛋白的基因重组还未成熟，通过抑制端粒酶的表达或使其灭活达到控制肿瘤的研究还处于起始阶段。有些中药可抑制逆转录酶的活性而对治疗艾滋病有部分疗效，是否可用来抑制端粒酶活性达到治疗肿瘤的目的，这正是中国学者感兴趣的问题。目前国内外学者正在加速这方面工作，以期找到一种广谱、高效、低毒副作用的抗肿瘤制剂。 0 O- J2 F' g' B4 w" _
五、端粒酶与抗衰老' ~5 E: d$ p0 C( i" U: `3 B
如前所述，细胞复制过程中，染色体端粒酶的不断缩短，导致了细胞衰老，是否可通过激活端粒酶以增加端粒长度而防止细胞衰老呢？1998年Bodnar等在Science上报道，已将克隆的端粒酶cDNA导入质粒，然后转染无端粒酶活性的正常人细胞，与未转染的细胞进行培养比较，发现经转染的细胞中的端粒明显加长，能够持续分裂，与对照细胞比较，细胞的生长寿命至少提高了20倍，对照细胞培养数代后出现强β－半乳糖苷酶活性(衰老标志)，而转染细胞则无该标志，并且转染细胞虽然显著提高了生存能力，但细胞形态及核型均无肿瘤细胞样的改变，这一研究提示基因工程改造的细胞既可延长细胞寿命，又不使其变为肿瘤细胞。这一研究目前最现实的意义是，向人们提供了研究正常生理和生化功能活动的细胞模型，及可能用人体正常细胞生产某些基因工程药物。8 n7 n- d3 m/ c+ \: \% U% A  ^
六、端粒酶的测定; G+ K/ `2 c9 ^  R8 J7 T" i7 ?; N
早期测定端粒酶活性的方法是通过测定细胞提取物将端粒重复片段加到一个合成的寡核苷酸、聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行放射自显影，该法敏感度极低，已被淘汰。1994年Kim等建立端粒重复扩增法(telomere repeat amplification protocol, TRAP)，该法将端粒酶的反应产物应用聚合酶链反应(PCR)大量扩增，使测定敏感度提高了约10000倍，是近几年来被全世界普遍采用的方法，但该法需将扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行放射显影，方法十分繁杂。国内有作者用银染法代替同位素显影，但方法仍然繁杂，检测敏感度却有所下降。1996年德国Boehringer公司用标记地高辛探针检测端粒酶扩增产物，推出了端粒酶－ELISA检测试剂盒，该法极大地简化了PCR产物检测操作步骤，4小时内即可得出检测结果，但我们在检测过程中发现试剂盒不同批号间常出现较大差异，并且试剂价格极为昂贵，无法在临床常规应用。虽现已有公司提供地高辛标记的引物，以此配制的试剂是否稳定，尚待进一步探讨。+ y  [- ]7 q- S+ b* P
由于荧光素标记引物较为简便、稳定，我们尝试用荧光素－抗荧光素系统代替Boehringer法中地高辛－抗地高辛偶联法，取得良好效果。具体方法如下：+ o6 T2 s" l; R' \
1．试剂和仪器 PMSF为德国Merck公司产品，CHAPS、β-巯基乙醇购自美国Sigma公司,streptavidin、酶标记抗FITC抗体、酶标板购自德国Boehringer公司。GeneAmp9600扩增仪，美国PE公司；2360K冷冻离心机，德国Hermle公司。' ~5 U2 E0 O$ n( F+ ~
2．引物合成 TS引物序列为5'Biotin AATCCGTCGAGCAGCGTT，CX为5`CCCTTA CCCTTACCCTTACCCTAA，探针CF为5`FITC-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAA。3 Y% F, @$ d. @+ X/ J3 ?0 U6 D* x
3．样本处理取组织50-100mg用手术刀片切成薄片，研磨均匀。组织碎片悬浮于200ul冷裂解液中(10mmol/L Tris-HCL,pH7.5,1mmol/L MgCl2,1mmol/L EGTA, 0.1mmol/L PMSF， 5mmol/L β-巯基乙醇，5g/L CHAPS， 100g/L甘油)，冰水浴30分钟，12000r/min离心30分钟，4℃，取上清迅速置-30℃，同时取50ul上清用考马斯亮蓝法测蛋白含量。
4．扩增于0.2ml离心管底加5.75umol/L CX引物2ul，加10ul低溶点石腊(Paraffin wax, Aldrich)，在石腊凝固后加46ul PCR反应液，其终浓度为10×Buffer 5ul，1.5mmol/L MgCl2，0.1g/L明胶，200umol/L dNTP，0.23umol/L TS引物，2u Taq酶。测定时加入样本处理上清液2ul，25℃ 30分钟，94℃ 5分钟，94℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 90秒，30个循环，72℃ 10分钟。; j: L$ d" a1 o# A
5．产物固相与杂交
⑴包被将Streptavidin溶于pH10.0碳酸盐缓冲液中，10mg/L，于微孔板每孔加100ul，4℃过夜，pH7.4 PBS洗3次，倒置于干净滤纸使干，4℃贮存备用，至少可用1月。⑵变性取0.6mol/L NaOH与扩增产物等量混合，室温10分钟。
⑶杂交与呈色于微孔板中加入100ul杂交液(0.25g Ficoll 400、0.25g BSA、0.25g PVP、0.0625g牛DNA，加入20×SSC 31.25ml、1mol/L HCL 375ml,加H2O至1000ml，含CF探针 50mmol/L)，25ul变性混合液，37℃ 1小时,pH7.4 PBS洗3次，加入酶标抗体(临用前用pH7.4 PBS 1:1000稀释)100ul，37℃ 30分钟，洗板3次，加入TMB呈色液100ul,37℃ 10分钟，加2mol/L H2SO4 100ul，分别于酶标仪450nm与690nm比色。
本法有较好的测定敏感度与重复性，较银染法更为简便快速，无同位素污染，检测成本低，有较好的推广应用价值。
结束语/ m; h) ~: I: e" o5 m4 h5 ]$ a
端粒酶的研究将有可能揭示肿瘤与衰老的秘密，一旦取得突破性进展，将可极大地延长人类的平均寿命。端粒酶的研究领域充满着神奇和精彩，值得我们去探索、去收获。

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