增强声环境中嗅球神经前体细胞在耳蜗核的迁移 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:27 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：陈阳　刘顺利　陈福权　乔莉　卢连军　邱建华　米文娟作者单位：西安第四军医大学西京医院耳鼻咽喉-头颈外科（西安　710032)




         6 e: s& ~: Q& g1 S; Y



      . b% g! a. M$ _6 j4 h
      $ Z" d7 z. E. b. \6 f8 H% w/ R: i

      【摘要】  目的　观察增强声环境中移植到大鼠耳蜗核的嗅球神经前体细胞的迁移特点，是否产生部位特异性的修复过程。方法　培养嗅球神经前体细胞取自孕14 - 16 d胚胎大鼠，荧光染色Hoechst 33342标记后移植到成年大鼠的耳蜗核内侧缘。移植大鼠分为A、B两组，A组置于增强声环境，B组在正常环境中饲养。14 d取材观察移植细胞的迁移和分化。结果　A组移植细胞有沿听觉神经通路移动的趋势。免疫荧光技术观察到Hoechst33342和神经元核蛋白（NeuN）、谷氨酸阳性三重标记的移植细胞。结论　嗅球神经前体细胞移植耳蜗核短期存活良好，增强声刺激可能促进前体细胞在听觉系统的迁移。

　　
      【关键词】　干细胞；　嗅球；　神经元；　移植；　增强声环境. X! B; I) Q! {
   　　Migration of neural precursor cells derived from olfactory bulb in cochlear nucleus exposed to an augmented acoustic environment0 f6 `  {5 `$ C

　　CHEN Yang, LIU Shun-li, CHEN Fu-quan, QIAO Li, LU Lian-jun, QIU Jian-hua, MI Wen-juan

　　Department of Otolaryngology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China" F4 T( J. R- e

　　3 C2 \& F& v0 s
$ _  U; n. O& _5 Z9 z5 ~" j
　　【Abstract】 Objective　Acoustic signals may induce a site-specific cell replacement in the auditory system. This hypothesis was tested with grafted implantation of neural precursor cells (NPCs) along the cochlear nucleus in the adult rat followed by an augmented acoustic stimulation. Methods　NPCs were obtained from the olfactory bulbs at embryonic day 14 - 16 and were transplanted into the inside border of cochlear nucleus. The host rats were divided into A and B group. After implantation, group A was raised in an augmented acoustic environment and group B in a normal condition. Migration and differentiation of the transplanted cells were observed on 14 day. Results　Directional migration along auditory tracts from the graft core clearly occurred in some animals exposed to the augmented acoustic environment. Hoechst 33342, NeuN and Glutamate tri-labeled cells were found in the cochlear nuclei with immunofluorescent technic.Conclusion　This observation demonstrates the survival and migration of NPCs from the olfactory bulb along the adult auditory nerve in an augmented acoustic environment following implantation.
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　　* G3 J0 [1 v! z4 D" Y
, w, \- s% Y& X) n
　　【Key words】　Stem cells;　Olfactory bulb;　Neuron;　Transplantation;　Augmented acoustic environment
2 _$ @4 A! e# A! t- ?
　　( _, o# f2 r6 p. k4 Y+ a8 c
( w* m7 e6 \& g# \$ L
　　世界范围内干细胞的研究已成热点，一些以前用传统医疗方法无法治愈的疾病，如神经系统退行性疾病（Parkinson 病、Alzheimer病等）、自体免疫性疾病、脑脊髓损伤等，正在探索是否可以通过干细胞的移植手段来解决。神经干细胞的分化和迁移调控是其能否成为临床治疗手段的关键问题之一。本项研究系将在体外培养的胚胎嗅球神经前体细胞定位注射到大鼠耳蜗核，观察增强声刺激对其分化、迁移的影响。' N8 v4 |. v! ~5 y7 L9 l  Y2 Y

　　1　材料与方法6 g0 Q3 B" |& I
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　　1.1　动物　清洁级孕14 - 16 d及成年Wistar大鼠，体重250 ～ 300 g、声反射灵敏，雌雄不拘，购自第四军医大学实验动物中心，清洁饲养条件下喂养。) ]( d' p# C1 a( r1 J9 l7 e! `$ W
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　　1.2　试剂　改良Eagle培养基（Dulbecco modified Eagle’s minimum essential medium，DMEM）/ F12(1： 1），Hanks平衡盐溶液（Hanks balanced salt solution，HBSS）购自美国HyClone公司，碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor-basic，bFGF)购自英国Pepro Tech公司，表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、多聚赖氨酸购自美国Sigma公司，B27购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。5-溴脱氧尿苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）及其单抗购自美国Sigma公司，小鼠抗巢蛋白（nestin）单抗、小鼠抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）单抗购自美国Neomarkers公司，小鼠抗神经元核蛋白（NeuN）单抗、兔抗Musashi单抗购自美国Chemicon公司，兔抗神经元特异性烯醇化酶（neuronal specific enolase，NSE）多克隆抗体、兔抗谷氨酸（glutamic acid，Glu）多克隆抗体、羊抗小鼠IgG-Cy3、羊抗兔IgG-FITC、羊抗兔IgG-Rhodamine荧光二抗购自武汉博士德公司。0 v0 b* q3 a9 i/ h7 {! z# |

　　1.3　大鼠嗅球神经前体细胞（NPC）的分离和培养

　　1.3.1　分离：怀孕14 ~ 16 d的大鼠被颈椎脱臼处死，取出胚胎大鼠，收集嗅球组织，置于4℃ 不含Ca2＋、Mg2＋的HBSS中漂洗2次后剪成小于0.5 mm  0.5 mm的碎块，0.125％胰蛋白酶37℃ 消化20 min，其间每5 min震荡1次，以1 000 r／min离心5 min。HBSS清洗2次，100目铜网过滤，用细胞培养液重新制成单细胞悬液。

　　1.3.2　培养：台盼蓝染色后细胞计数，以5  　　105 ／ml的活细胞密度接种于细胞培养瓶内，用无血清培养液DMEM／F12(1: 1)培养，内含B-27(1: 50)、100 U／ml青霉素、100 U／ml链霉素、20 ng／ml EGF、20 ng／ml bFGF，置于体积浓度为5％CO2的培养箱(37℃)内培养。细胞每5-7 d传代1次，台盼蓝染色后细胞计数，以5  105 ／ml的活细胞密度传代。/ s2 R+ Z' V( C

　　1.4　神经干细胞鉴定+ ^7 k( k) k  }) S/ Z
% E( z2 d% J' [
　　
/ e; K9 o4 s9 f' Y! g" K. c* n
　　取第2代含神经球的培养液加入10 μmol/L BrdU孵育24 h标记后滴在预先用多聚赖氨酸处理的盖玻片上，37℃ 继续孵育。2 h后取出，冷风吹干，4℃多聚甲醛（四硼酸钠溶液，pH 9.5）固定　15 min；2 mol/L HCl 37℃ 30 min ，磷酸缓冲液(PBS)漂洗6遍；正常山羊血清封闭20 min；小鼠抗nestin单抗（1:500）或兔抗Musashi单抗（1: 200）4℃过夜，羊抗小鼠IgG-Cy3或羊抗兔IgG-Rhodamine荧光二抗20 min（37℃）。上述步骤除正常山羊血清封闭后不洗直接加一抗外，其余步骤均用0.1 mol／L PBS洗涤。80％甘油封片，Olympus－BX 51荧光显微镜下观察。阴性对照以磷酸缓冲液代替一抗。
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　　1.5　细胞移植( ?4 C9 O* H& ]. i- y* X8 F; r

　　4 A. l4 m3 s& b) a# G

　　取自孕14天的大鼠嗅球按照前面的方法培　养增殖10天, 移植前1小时加入Hoechst 33342　（10 μg/ml）孵育。用细胞计数器调整移植干细胞的浓度大约 2.0  104 / 1 μl。选择250 ～ 300 g的成年Wistar大鼠40只，2％戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉后固定在WDF V型脑立体定位仪（西北光电仪器厂，西安），颅顶中线切口，暴露冠状缝与人字缝。用耳科钻在颅骨右侧磨一直径3 mm的小孔，暴露硬脑膜。按照大鼠立体定位图谱bregma点以后10.3 mm，中线右侧3.85 mm，硬膜下6.1 mm(Paxinos G and Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 4th ed. San Diego：Academic Press，1998）注射到右侧耳蜗核内侧缘。采用内径约100 μm的玻璃微管和10 μl的微量注射器, 在1分钟内匀速注入2 μl 干细胞悬液，留针5 min，退出后用骨蜡封闭骨孔。40只大鼠随机分为A、B两组，A组20只大鼠在移植干细胞后置于增强声环境，而B组在常规条件下饲养。
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　　1.6　暴露增强声环境2 U2 M' W9 n% p8 y* x* t

　　$ M4 e$ B. ?1 @3 T( r* D3 e4 G
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　　A组的大鼠在移植干细胞后即置入40 cm 30 cm  30 cm的特制带顶置喇叭的不锈钢笼子，接受每天持续12 h的增强声刺激，连续7天，笼内保持饮水和饲料。声刺激为宽带调制白噪声(强度 = 70 dB SPL，上升下降 = 10 ms，平台 = 200 ms，速率 = 2 次/s)，通过前置放大器接于笼顶的扬声器。

　　1.7　取材和免疫荧光观察8 ?; i) _) _9 `$ e
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　　! m) [" u& f% w. c- w- M

　　移植术后2周，大鼠过量麻醉后经左心室依次灌注4℃ 生理盐水100 ml和4％多聚甲醛300 ml，取脑干置入4％多聚甲醛固定12 h，然后移入30％蔗糖中直到沉底，并行冠状面连续冰冻切片(厚　16 μm)备用。免疫荧光染色：0.3％ H2 O2室温　　30 min，5%小牛血清室温封闭15 min，一抗4℃过夜：小鼠抗NeuN（1: 2００）、兔抗NSE（1: 5０）、兔抗GFAP（1: 5０）、兔抗Glu(1: 5０），羊抗兔IgG FITC、羊抗小鼠IgG Cy3荧光二抗37℃ 30 min，甘油封片观察。2 u% u0 R% K8 G: ~

　　2　结果% `9 h. l; j2 e/ u- H( Z
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　　2.1　神经前体细胞培养与鉴定
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　　大鼠嗅球神经前体细胞的培养结果与前期实验相同［1］，第1天出现细胞分裂和积聚，第2天出现悬浮状态的神经球并逐渐增大。部分细胞贴壁，胞体增大数倍，伸出树突样结构。培养2周后神经球可以达到300 μm，同时贴壁分化的细胞明显增多。免疫荧光染色显示神经干细胞为BrdU阳性细胞核，与胞浆蛋白nestin、胞核蛋白Musashi双重标记（图1）。

　　2.2　干细胞的标记和移植1 x8 Z. P5 q1 a0 _" g  O
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　　: q' g' ~8 @# O/ i' {! E
4 B/ H& j; g6 ]# N# l
　　Hoechst标记神经干细胞达99%，表现为散在或聚集成球的兰染圆形或椭圆形细胞核。实验组和对照组各有一只动物因追加麻药后窒息死亡。术后切口愈合良好，无一发生感染。有三只动物术后出现平衡障碍，表现为不能直线行走，术后一周逐渐自行恢复。5 P# ?8 ?* D0 q; q. j
4 a2 k. F# O" [6 v- _$ G
　　2.3　移植细胞的迁移和分化
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　　在荧光显微镜下观察耳蜗核冠状面连续冰冻切片，在耳蜗核注射点发现Hoechst标记的移植细胞进行免疫荧光染色，否则放弃。试验组有9只大鼠、对照组有8只大鼠脑干切片在耳蜗核附近发现了Hoechst标记的移植细胞，表现为纺锤形或椭圆形分布的兰染圆形或椭圆形的细胞核。实验组的移植细胞有沿听觉神经纤维向第八颅神经根和耳蜗核交叉纤维-斜方体移动的趋势，而对照组多数呈弥散性扩散移动（图2 A，B）。自注射点到移植细胞分布的外缘的平均距离，实验组为530 ± 126 μm （n = 5），对照组为252 ± 48 μm（n = 4）。部分标本因注射点范围过大而弃用。移植的标记细胞用抗NSE 或 NeuN行免疫荧光染色，以判断嗅球来源的神经前体细胞在耳蜗核是否能分化为神经元。可以看到胞核兰染、胞体NSE阳性的细胞并且有树突样突起（图2，C）。NSE和NeuN阳性的移植细胞仅占大约10 %，更多的移植细胞表现为GFAP阳性（图2，D）。移植的部分细胞同时表达成熟神经元的特异性抗体NeuN(红色的胞核)以及耳蜗核传入神经递质谷氨酸（绿色的胞体，图2，E）。: Z( O3 I& O4 m! M( V
- E) {5 k0 m; v) l* f. Q
　　3　讨论0 w3 U2 `  a! m

　　

　　本研究尝试用同属感觉神经的嗅球神经前体细胞进行耳蜗核的干细胞移植修复，因为嗅球神经前体细胞在成年哺乳动物不断产生［2-3］，避免了胚胎干细胞取材的伦理问题，更重要的是，嗅球新生神经元的成熟受到感觉刺激信号的诱导和调控。出生后暴露于复杂的气味环境会增加成年小鼠嗅球中新生神经元的数量，增强其嗅觉记忆，BrdU标记的新生神经元数量在脱离复杂气味环境后一个月又恢复到正常水平［4］，嗅觉剥夺后神经祖细胞向嗅球各不同层面的上升迁移受到破坏［5］。这些实验表现出嗅球前体细胞对环境信号和功能需求的强大的适应力。而增强的声刺激可能对耳蜗核神经元的成熟和修复具有正相的调节作用。因为大鼠的听觉中枢神经系统在出生时还不成熟，生后1月才能引出稳定的听觉脑干诱发电位，而增强的声环境甚至可以减轻遗传性耳聋大鼠的听力损伤和耳蜗核的病理改变［6-7］。因此，我们选用增强声环境作为移植干细胞向听觉脑干定向迁移和分化的诱导因素，所选择的刺激声强度70 dB慢性暴露不会造成继发的噪声性听力损伤。

　　
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　　BrdU作为胸腺嘧啶脱氧核苷的类似物，是典型的增殖标志物来标记的分裂细胞及其子代。它与两种神经干细胞标志物，胞浆蛋白nestin和胞核蛋白Musashi的双重标记充分证实了培养的嗅球细胞中存在神经干细胞。由于BrdU的免疫细胞化学法检测需要盐酸裂解胞膜，容易造成脑片的损坏。我们在移植嗅球前体细胞时采用了DNA荧光染料Hoechst 33342，其标记率可达到99%[8]。

　　6 A( e$ C0 C9 Z

　　用大鼠脑定位注射技术对移植区会造成一定的物理损伤[9]，外源性的神经前体细胞可能会参与损伤的修复过程。实验观察到标记的移植细胞在异体大鼠耳蜗核可以存活2 周，并且分化出神经元和神经胶质细胞，部分神经元甚至表达传入神经递质谷氨酸。Hoechst 33342标记的细胞在增强声环境下有沿听神经根迁移的趋势。除了向腹外侧听神经根移动，还有的沿斜方体的听觉交叉纤维移动。其可能的原因是增强的听觉神经活动对神经干细胞有趋化作用。因此，体外培养的嗅球神经前体细胞有可能用于听觉神经系统的修复，而增强的声信号可能会促进听觉系统的定向、定位修复。但是，移植细胞的长期存活以及是否能与既有的神经通路发生突触连接还须进一步观察。* E% `2 q! ?3 |# \
      【参考文献】
　　1　陈阳, 陈福权, 邱建华, 等. 毒性损伤大鼠耳蜗核移植嗅球神经前体细胞的初步观察. 中华神经外科疾病研究杂志， 2007， 6(1)： 44-48.3 x" L- v$ }2 o' m

" K6 a. g) R5 n; K
& A  V3 V' f: V1 ?8 |1 b
　　2　Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science, 1992， 255(5052): 1707-1710.
* T, j( x. p7 q
* C9 j0 ?. y$ u2 A" E" Q1 R5 Q% k6 g9 C

　　3　Weiss S, Reynolds BA, Vescovi AL, et al. Is there a neural stem cell in the mammalian forebrain? Trends Neurosci，1996, 19(9): 387-393.+ r) P$ A/ I2 O# [7 \) ~+ s

* Q% Q% G$ x' B+ N) Q3 Z) M/ f
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　　4　Rochefort C, Lledo PM. Short-term survival of newborn neurons in the adult olfactory bulb after exposure to a complex odor environment. Eur J Neurosci, 2005, 22(11): 2863-2870.# U# ~" V: x; a( [
" C' M+ h) L) _& }  u* `

　　5　Rochefort C, Gheusi G, Vincent JD, et al. Enriched odor exposure increases the number of newborn neurons in the adult olfactory bulb and improves odor memory. J Neurosci, 2002, 22(7): 2679-2689.
2 h2 W0 [$ h, M! \6 c7 K2 r) c5 c& P
% o! [( X. o3 t" U# d3 O' B

　　6　Willott JF, Bross LS. Effects of prolonged exposure to an augmented acoustic environment on the auditory system of middle aged C57BL/6J mice: cochlear and central histology and sex differences. J Comp Neurol, 2004, 472（3）: 358-370.
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　　7　Willott JF, Bross LS, McFadden SL. Ameliorative effects of exposing DBA/2J mice to an augmented acoustic environment on histological changes in the cochlea and anteroventral cochlear nucleus. J Assoc Res Otolaryngol, 2005, ６(3):234-243.

, R* U# |& ^( ]3 I; [8 ?
5 W2 ^; p4 D: R
　　8　Chen Y, Qiu JH, Chen FQ, et al. Migration of neural precursor cells derived from olfactory bulb in cochlear nucleus exposed to an augmented acoustic environment. Hea Res, 2007, 228(1-2): 3-10.: z: f# n) D# x% `
' c& X( @: L6 P5 i3 `7 ]5 ^+ t

　　9　陈阳, 邱建华, 刘顺利. 外源性谷氨酸对大鼠耳蜗核的毒性损伤实验研究. 听力学及言语疾病杂志, 2007, 15(1): 54-56.

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